DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE LA SYPHILIS

1. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE LA SYPHILIS Dr Patrice Sednaoui Institut Alfred Fournier Paris

2. INTRODUCTION • Ulcération génitale = perte d’intégrité des muqueuses (ou de la peau génitale) • Etiolgies: ○ Infectieuses (IST)++ ○ Dermatologiques ○ Inflammatoires ○ Néoplasies ○ Traumatiqueset caustiques

3. ETIOLOGIES INFECTIEUSES IST • Virus Herpès simplex (HSV) • Treponema pallidum (syphilis) • Haemophilus ducreyi (chancre mou) • Chlamydia trachomatis (LGV) • VIH (primoinfection) • Donovanose (rare) • Candidose érosive (primitive ou opportuniste) • Infection opportuniste chez l’immunodéprimé

4. Interrogatoire - comportement sexuel du patient - circonstances déclenchantes - notion de récidive - délai: rapport/ premiers symptômes - Antécédents (IST, terrain..) • Examen clinique - caractéristiques de la lésion - recherche d’adénopathies - examen génital complet • Diagnostic biologique → doit être guidé par:- le contexte clinique (examen soigneux) - l’interrogatoire - l’épidémiologie

5. En général • Toute ulcération génitale doit faire évoquer une cause infectieuse → réaliser un bilan IST complet • Rôle important des ulcérations génitales dans la transmission et l’acquisition de l’infection par le VIH → rechercher une co-infection avec le VIH • Importance de la qualité du prélèvement dirigé pour l’obtention d’un résultat fiable

6. Privilégier des prélèvements de qualité au laboratoire • Prélèvements « orientés » • Avant tout traitement antibiotique ou antiviral • Si possible au laboratoire par personnel qualifié • Ecouvillons et milieux de transport adaptés • Ensemencement rapide, si possible sur place au laboratoire: - Milieux classiques et lames : examen cytobactériologique - Plus milieux et lames pour recherches spécifiques: → De façon systématique on réalisera - Un examen direct au microscope à fond noir (syphilis) - Une culture cellulaire pour la recherche d’herpès - Eventuellement une recherche d’Haemophilus Ducreyi - Des sérologies HIV et TPHA VDRL(à refaire 3 mois + tard) - Examens complémentaires orientés

7. INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE Syphilis 2000-2004 • Hommes : 96% - Femmes : 4% • Homosexuels masculins : 84% • Age moyen : 36.5 ans • Fellation non protégée : pratique à l’origine de la contamination (55%) • Co-infection VIH : 61% en 2000 à 42% en 2003 et 2004

8. INSTITUT DE VEILLE SANITAIRE Syphilis (données partielles nov04)Nombre de cas de syphilis par région et par semestre, 2000-1er semestre 2004

9. Treponema pallidum • Famille des spirochaetaceae, genre Borrelia, Leptospira et Treponema • 4 sous-espèces de T.pallidum différentes pathologies • T. pallidum subsp. pallidum syphilis • T. pallidum subsp. pertenue  pian • T. pallidum subsp. endemicum bejel • T. pallidum subsp. carateum  pinta ou carate (tréponématoses endémiques) • Aucun tréponème n’a été cultivé in vitro

10. Structure antigénique de T. pallidum • Très complexe alors que le génome est très petit (900 Kbp). • Grande diversité dans la réponse anticorps mise en évidence par des tests différents. • Membrane d’enveloppe  peu immunogène • Lipoprotéine de l’espace périplasmique  très immunogène (Lp 47 Kd) • Endoflagelles  immunogènes • Peptidoglycane  peu immunogène • Membrane cytoplasmique  contient le cardiolipide (haptène de Wasserman)

11. Diagnostic biologique direct Prélèvement des lésions primaires et secondaires (chancre, ganglions, plaques muqueuses) Sérosité qui sourd de l’ulcération Prélèvement entre lame et lamelle Microscope au fond noir : fine bactérie spiralée régulièrement d’une longueur de 5 à 20 µm, mobilité en spirale, flexion, en avant. IFI : intéressant si la lecture est différée Imprégnation argentique de Fontana Tribondeau : peut déformer les spires

19. Détection génomique de T. pallidum • PCR +++ car T. pallidum non cultivable. • Dans échantillons biologiques ou T. pallidum sont peu nombreux • Syphilis congénitale • Neurosyphilis •  Situations où l’interprétation sérologique peut être difficile. • Liquide amniotique : PCR sensible et spécifique • LCR : résultats inconstants • Faux négatifs par présence d’inhibiteurs • Persistance du génome longtemps après la fin du traitement chez les sujets guéris • PCR ne permet pas de différencier T. pallidum de T. pertenue. • Technique lourde.

20. Diagnostic sérologique • Très important car tréponèmes non cultivables in vitro. • 2 types de réactions selon la matière de l’antigène utilisé. • Tests à antigènes non tréponémique (cardiolipides) • Tests à antigènes tréponémique détectant des anticorps spécifiques des tréponèmes

21. Réactions à antigènes non spécifiques VDRL ou RPR • Antigène : suspension de microcristaux de cholestérol • + cardiolipide • +- charbon ou latex coloré • Principe : en présence d’anticorps anticardiolipides  agglutination de l’antigène visible à l’œil nu ou au microscope • Dilution de dépistage : pure • Si positif : dilution de 2 en 2 • Intérêt : • Anticorps se positivant précocément en primo-infection • Bon indicateur d’efficacité du traitement • Inconvénient : • Peu spécifique • Phénomène de zone

22. Réactions à antigènes tréponémiques • THPA • FTA abs • EIA • TPI ou test de Nelson • Western blot

23. Les réactions à antigènes tréponémiques de dépistage • TPHA ou hémagglutination passive : • Lysat de T. pallidum absorbés sur hématies • Intérêt : peu coûteux, simple, spécifique • Inconvénients : • Se positive plus tardivement • Titres peu influencés par l’antibiothérapie • Rares faux positifs • FTA-abs ou immunofluorescence indirecte : • Suspension de T. pallidum fixés sur lame • Sérum dilué et absorbé auparavant dans extraits de tréponèmes de Reiter, testicules de lapins, hématies de mouton • Intérêt : réaction la plus précoce et la plus sensible • Inconvénients : • Diffcile à standardiser, lecture délicate • Titres peu influencés par l’antibiothérapie • EIA : • Extraits antigéniques natifs ou recombinants • Intérêt : automatisable • Limites : qualitatif uniquement actuellement

24. TPHA • Antigène : lysat de T. pallidum souche Nichols absorbés sur des hématies (aviaires, humaines, ovines) • Principe : la présence d’anticorps spécifiques  hémagglutination des hématies qui forment un voile d’agglutination à la surface des cupules réactionnelles • Dilution de dépistage : 1/80 • Si positif, dilution de 2 en 2 • Intérêt : test facile, peu coûteux, automatisable, spécifique • Limites : • se positive plus tardivement que le FTA-abs en début d’infection • peu influencé par le traitement • Quelques faux positifs

26. Immunofluorescence indirecte (FTA-abs) • Antigène : suspension standardisée de T. pallidum fixés sur une lame • Principe : le sérum est dilué au 1/5 dans un sorbent (ultrasonat de tréponèmes de Reiter, globules rouges de mouton et de bœuf, extrait de testicules de lapin). La fixation des anticorps aux tréponèmes est révélée à l’aide d’anticorps marqués à la fluoresceine • Dilution de départ : 1/200 • Si positif, titrage par dilution de 2 en 2 • Intérêt : peut confirmer précocement une syphilis débutante. • Limites : • peu adapté aux grandes séries • Faux positif (maladies auto-immunes et infectieuses) • Personnel expérimenté • Matériel

27. EIA • Antigènes : natifs ou recombinants fixés sur plaque à microtitration • Principe : les anticorps fixés sont révélés par les antiglobulines marquées et révélés par substrat chromogène • Intérêts : • Détecte les IgG et/ou les IgM • Lecture spectrophotométrique objective, automatisable • Dépistage de grande séries (CTS) • Limites : • Tests uniquement qualitatifs • Ne dispense pas actuellement de réaliser les autres tests si positif

28. Les réactions tréponémiques de confirmation • Détection des IgM spécifiques • Western-blot • Test de Nelson

29. Détection des IgM spécifiques • 4 techniques : • FTA-abs IgM : • Sur sérum total • Sur fraction 19S IgM après ultracentrifugation • SPHA • EIA IgM • Intérêt : • IgM sont les premiers anticorps à apparaître en cas de primo-infection • IgM positives = syphilis active • Chez le nouveau-né : IgM+ affirme un syphilis congénitale • Chez le patient traité : la persistance d’IgM fait craindre un échec thérapeutique et indique la nécessité d’un nouveau traitement

30. Western blot ou immuno-empreintes sur tréponèmes • Il existe plus de 22 antigènes tréponémiques polypeptidiques réagissant avec les sérums de sujets syphilitiques • Mais de nombreux essais ont montré que 3 protéines étaient suffisantes et essentielles pour affirmer une positivité : • La lipoprotéine membranaire majeure de 47 kD • Deux protéines membranaires de 17 kD et de 14.5 kD • Intérêt : • Réactifs commercialisés prêts à l’emploi • Permettant de détecter des IgG et les IgM en 3h • Réalisation facile • Très sensible et très spécifique • Inconvénient • Utilisation de tréponèmes pâles provenant de testicules de lapin

31. Test de Nelson • Antigène : tréponème vivant, mobile, en milieu de survie • Principe : mettre en présence une suspension de T. pallidum vivants, le sérum du patient décomplémenté et du complément de cobaye  si anticorps spécifiques, activation du complément qui lyse la membrane externe du tréponème  immobilisation en comparaison à un témoin sans complément. • Dépistage : sérum au 1/10 = % d’immobilisation • Si positif : dilution de 2 en 2 • Intérêt : • test spécifique longtemps condidéré comme le test de référence • Se positive en fin de phase primaire • Titres élevés en phase secondaire • Titres faibles dans les phases latentes et tardives • Limites : • Très lourd • Entretien de la souche • Lecture subjective

32. Cinétique des anticorps: syphilis traitée • Si traitement au début du chancre : la sérologie peut rester négative • Si traitement au stade de syphilis primaire: chute rapide des anticorps (2 à 4 dilutions pour VDRL) et disparition en 3 à 6 mois • Si traitement au stade de syphilis secondaire récente (3 à 6 mois après le contage) une négativation des anticorps est possible en environ un an • Si traitement plus tardif: chute des IgM et du VDRL (négatif 1 cas/2), mais persistance d’une cicatrice sérologique en TPHA et +- FTA

33. Cinétique des anticorps: syphilis traitée

34. TypeInterprétation TPHA- -absence de tréponématose VDRL- -tréponématose très récente - tréponématose guérie (traitée précocement) TPHA+ - tréponématose traitée ou non VDRL+ guérie ou non (syphilis évolutive ou latente ou cicatrice) TPHA- - faux + VDRL+ - syphilis très précoce (1ers jours du chancre) TPHA+ - tréponématose guérie VDRL- - tréponématose latente - syphilis très précoce (1ers jours du chancre) - syphilis tertiaire très ancienne (rare) - faux positif (rare)

35. L'interprétation d'un résultat positif doit prendre en compte: - Le titre des anticorps - Les signes cliniques et les antécédents - L'âge et l'origine géographique En pratique: Face à des tests de dépistage positifs ou dissociés: → Confirmer la positivité du TPHA par FTA-abs (ou éventuellement WB) → Rechercher une syphilis active par la présence d’IgM. → Effectuer un contrôle sérologique sur un 2d prélèvement Dans le doute: → Il vaut mieux traiter afin de couvrir une syphilis latente et faire un suivi sérologique → C’est la diminution du VDRL (4 fois en 6 mois) qui permet de suivre l’efficacité du traitement

36. POINTS ESSENTIELS • La syphilis reste un problème mondial de Santé Publique, recrudescence depuis quelques années ++ • Un chancre syphilitique doit systématiquement être évoqué devant une ulcération de muqueuse (génitale, anale, buccale) • En pratique courante : recherche de tréponème si possible et diagnostic sérologique classique associant VDRL-TPHA • Si contexte de contage récent: TPHA et VDRL- n’excluent pas le diagnostic d’une syphilis débutante • La confirmation par le FTA-abs et/ou par l’immunoblot associés à la détection des IgM est d’une très grande sensibilité. • Aucun examen sérologique ne peut différencier une syphilis d’une tréponématose non vénérienne • Examiner et traiter les partenaires • Prévention et information indispensables

37. Conclusion • La syphilis reste un problème mondial de Santé Publique, malgré les disparités de sa prévalence selon les pays et selon la qualité de la prise en charge médicale • T. pallidum reste sensible à la pénicilline, ce qui permettrait d’envisager son éradication, ce d’autant que le seul réservoir connu est humain • L’impossibilité de cultiver T. pallidum reste un problème majeur à la compréhension de la pathogénèse de la maladie et au diagnostic • Le diagnostic sérologique classique associant VDRL-TPHA reste d’un grand intérêt en pratique courante • La confirmation par le FTA-abs et/ou par l’immunoblot associés à la détection des IgM est d’une très grande sensibilité.