Metody histologického studia

1. Metody histologického studia (biologická technika)

2. Histologie - z řečtiny: histos = tkáň, logos = nauka Zařazení histologie: * biologie * morfologie * histologie * cytologie * obecná histologie * speciální histologie * histotechnologie Rozdělení histologie: - obecná - speciální

3. Příbuzné a související obory: • buněčná biologie • histopatologie • histochemie • imunohistochemie • anatomie • morfologie • Využití: • v medicíně při zkoumání patologických změn tkáně • pomocí histochemických technik lze prokázat přítomnost látekv buňkách a tkáních

4. Tkáň • soubor morfologicky podobných buněk, které plní určitou funkci • buňky tvořící tkáň mohou stejného typu, nebo existují tkáně tvořené buňkami tvarově i funkčně rozdílnými • Typy tkání: • epitelová (krycí) • pojivová • * vazivo • * kost • * chrupavka • svalová • * hladká • * příčně pruhovaná epitel kolagenové vazivo měkkýše

5. nervová • * neurony • * neuroglie • tekutá (trofická) • * krev • * krvomíza • * míza kost krev

6. Postup při přípravě preparátu • Odběr tkáně • Fixační činidla • Zalévání • Krájení na mikrotomech • Barvení • Mikroskopy

7. Odběr tkáně • Odběr tkání a buněk: • Ze živého organismu (BIOPSIE) • Z mrtvoly (NEKROPSIE) • Je nutno provést fixaci, jinak se tkáň vlivem vlastních enzymů a působením bakterií rozloží (AUTOLÝZA) • Blok tkáně pro fixaci ve světelné mikroskopii nemá být větší než 1cm3

8. Fixační činidla • Fixace zastaví metabolické děje v buňce buď jejich zpomalením nebo denaturací enzymů. • Fyzikální metody: • Teplo (mikrovlnná trouba) • Zmražení (tekutý dusík – 170 oC) • Chemické metody: • Imerzní (ponoření do fixační tekutiny) • Perfuzní (nástřik cév)

9. Fixační činidla - Chemická fixace

10. Fixační činidla - Fixační tekutiny

11. Zalévání • Pro krájení je nutno tkáň zpevnit zalitím do zalévacích médií (parafin, celloidin) • Protože tato media nejsou mísitelná s vodou, je nutno vodu z tkání odstranit vzestupnou řadou alkoholů (odvodnění) a poté prosytit rozpouštědlem zalévacího media (xylen, toluen, aceton), který tkáň „projasní“ • Pro zhotovení dostatečně tenkých a kvalitních řezů pro studium je nutné tkáň zalít do média, které ji zpevní a vytvoří homogenní blok vhodný ke krájení • Pro světelné mikroskopické studium bývají řezy tlusté 4 - 20 µm, pro elektronové mikroskopy zpravidla 100 nm a tenčí

12. Krájení na mikrotomech • Tkáň je třeba nakrájet na řezy o tloušťce jedné vrstvy buněk, tedy 4-10mm. Tkáň je pak průhledná a „dobře čitelná“ • Přístroje, které se k tomu užívají se jmenují mikrotomy. • Nakrájené řezy se dávají na podložní sklo, kde se teplem natáhnou. K přilepení se používá bílek-glycerin

13. mikrotom zn. Leica laserový mikrotom

14. Barvení • Umožňuje rozlišení jednotlivých součástí buněk a tkání. • Barviva jsou rozpustná ve vodě, proto je třeba z řezu odstranit parafin. • Po obarvení se řez montuje do pryskyřic. Tak vzniká trvalý preparát, který se prohlíží v mikroskopu.

15. Barvení • Z řezů je třeba odstranit parafin a znovu je zavodnit, aby bylo možno tkáně barvit. • Většina barviv je rozpustných ve vodě.

16. Trvalý preparát • Po obarvení se z tkáně znovu odstraní voda • Trvalý preparát se připraví přilepením krycího skla pomocí kanadského balzámu (má stejný lom světla jako sklo) nebo umělých pryskyřic Po zaschnutí vznikne TRVALÝ PREPARÁT

17. Postup

18. Barvení • Přehledná • Hematoxylin eosin • Massonovy trichromy • Weigert van Gieson • Heidenhainův železitý hematoxylin • Selektivní • Weigert resorcin fuchsin • Impregnace stříbrem

19. Hematoxylin - eosin

20. Zelený Massonův trichrom

21. Žlutý Massonův trichrom

22. Weigert-van Gieson

23. Heidenhainův železitý hematoxylin

24. Weigert resorcin - fuchsin

25. Impregnace stříbrem

26. Další barviva

27. Barvení dle Pappenheima

28. Kresylová violeť

29. Luxolová modř

30. Methylenová modř

31. Mikroskop • Stativ • Mikrometrický šroub • Optický systém: • Okuláry • Objektivy • Kondenzor • Zdroj

32. Rozlišovací schopnost • Rozlišovací schopnost je nejmenší vzdálenost mezi dvěma body, při které je ještě dovedeme rozlišit jako dva samostatné objekty. • Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je 0,2 mm.

33. Konec