Kantasolut ja Soluterapia

1. Kantasolut ja Soluterapia Mika Pietilä Luentosarja TKK, 11-26.02.2010

2. Kantasolut lääketeollisuudessa

3. Kantasolut lääketeollisuudessa: Lainsäädäntöä • EU:n direktiivi 86/609/EEC • Koe-eläinten suojelulaki • Kattaa kaikki eläinkokeet, jotka liittyvät seuraaviin prosesseihin • Lääkkeen ja kemikaalin kehitys • Fysiologiset tutkimukset • Ympäristövaikutusten tutkiminen • Uusien ruokalisien testaus • Artikla 7 • Edellyttää käyttämään muuta olemassa olevaa menetelmää eläinkokeen tilalla • “. . .An experiment shall not be performed if another scientifically satisfactory method of obtaining the result sought, not entailing the use of an animal, is reasonably and practicably available (Art.7.2). . .”

4. Kantasolut lääketeollisuudessa: Lainsäädäntöä • Direktiivi vaatii uusien korvaavien menetelmien kehitystä, validointia ja hyväksyttämistä • 3R’s principle • Reduce, refine or replace the use of laboratory animals • OECD guidance document 34 • Tiukat kriteerit vaihtoehtoisten in vitro toksisuustestien validoimiseen • GLP (Good Laboratory Practise) • GCCP (Good Cell Culture Practise) • Kantasolujen kohdalla vaaditaan ylimääräisiä laatukriteereitä niiden ainutlaatuisen ominaisuuden takia • Pluripotenssin ja erilaistumispotentiaalien osoittaminen

5. Kantasolut lääketeollisuudessa: Lainsäädäntöä • REACH (Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals) • Regulation (EC) No 1907/2006 • Kannustaa myös uusien vaihtoehtoisten menetelmien kehittämistä uusien kemikaalien testaukseen (artikla 1) • Annex XI • In Vitro testien tulosten tulkitseminen • Results from suitable in vitro methods • Results from validated in vitro methods

6. Kantasolut lääketeollisuudessa: Lainsäädäntöä • ”Cosmetic directive” (76/768/EEC) • Eläinkokeiden poisto kosmeetiikkateollisuudessa • Poikkeuksena toistetun annosmäärän toksiuus (Repeated-dose Toxicity), lisääntymiskykyisyyteen liittyvät toksisuus testit ja toksikokineettiset tutkimukset • Kantasolut nähdään näihin hyvinä korvaajina • Workshop 2008: New Perspectives on Safety of the European Partnership on Alternative Approaches (EPAA) • Esiteltiin 11.3.2009 • Dead line 11.3.2013

7. Kantasolut lääketeollisuudessa

8. Kantasolut lääketeollisuudessa • Kantasolut soveltuvat hyvin testimateriaaliksi • Herkkiä soluja • Voimakas jakautumiskyky • Mahdollista tuottaa erityyppisiä soluja/malleja toksisuustestaukseen • In vitro solumallit vähentää lajien välisistä eroista johtuvia virheitä (vrt. Eläinkokeet) • Mahdolliset kantasolutyypit • Alkion kantasolut • Aikuisen kantasolut (mesenkymaaliset) • iPS

9. Kantasolutyypit: Ihmisen alkion kantasolut • Käyttöä tutkimuksessa rajoittaa eettiset ja lainsäädännölliset tekijät • Tiukka tieteellinen ja eettinen arviointi ennen hyväksyntää • EU rahoittaa 18 projektia, joista 4 keskittyy toksisuustestien kehittämiseen

10. Kantasolutyypit: Ihmisen alkion kantasolut Vojnits and Breme. Toxicology 2010, DOI:10.1016/j.tox.2009.12.003

11. Kantasolutyypit: Ihmisen alkion kantasolut • Etuja: • Jatkuva jakautumiskyky • Solupankkien pystyttäminen • Voidaan karakterisoida muutama linja  standardoitu testausmateriaali • Pluripotentiaalinen erilaistumiskyky • Erilaisia solutyyppejä (esim sydänlihassolut) • Kehitettävää: • Laatukontrollien kehittäminen • Linjojen välillä eroja erilaistumiskyvyssä ja erilaistumattomuusasteessa • Identiteetin määrittäminen, pitkäaikainen stabiilisuus, erilaistumiskyky (Loring and Rao. 2006. Stem Cells 24(1):145-150) • Reference standards

12. Kantasolutyypit: Ihmisen alkion kantasolut Vojnits and Breme. Toxicology 2010, DOI:10.1016/j.tox.2009.12.003

13. Kantasolutyypit: Induced Pluripotent Stem cells • Alkion kantasolun kaltaisia • Ei eettisiä ongelmia • Samat edut kuin alkion kantasoluissa • Laatukontrollit • Morfologialtaan alkion kantasolun kaltaisia, rajaton proliferaatiokyky • Geeniekspressio alkion kantasolujen kaltainen • Pluripotentiaalinen erilaistumiskyky • Pintamarkkerit: SSEA-3 ja 4, TRA-1-60 TRA-1-81 • Teratooman muodostus in vivo • Pluripotentiaalisuuden säätelytekijät • Oct4, Sox2, Nanog, C-Myc, Klf4, Lin28

14. Kantasolutyypit: Aikuisen kantasolut/primaarisolut • Mesenkymaaliset kantasolut • Luuydin, napaveri, rasvakudos • Somaattiset primaarisolut • Maksasolut, ihon fibroblastit • Etuja: • Ihmisen fysiologisia soluja  solujen oikeanlainen toiminta • Heikkouksia: • Vaikeita standardoida (potilaiden välillä suuria eroja solujen toiminnassa) • Mahdollisia toiminnallisia muutoksia • Menettäneet tärkeät toimintakyvyt • Lääkeresistenssi?

15. Erilaisia sovellutuksia in vitro toksisuustestaukseen • Alkion kantasoluista erilaistetut sydänlihassolut • Ainutlaatuinen lähde • Eristetyt sydänlihassolut huonoja kasvamaan in vitro • Minimoidaan lajien väliset erot (eläinkoe) • Sydän tärkeä elin  lääkkeiden sivuvaikutukset tärkeä kartoittaa

16. Kantasolut toksisuusmäärityksissä • Lääkeainekokeilut: - Ylärivillä perustaso - 0.017 mg/ml isoprenalin - 14.3 mg/ml esmolol - 25 mg/ml esmolol • Johtavuus: - sykintä alkaa elektrodista a - etenee b:n kautta c ja d d a b c

17. Kantasolut toksisuusmäärityksissä Control 100nM Noradrenaline

18. Kantasolut toksisuusmäärityksissä • Muut hyödylliset kantasolumallit: • Osteoblastit ja luukudos • Adiposyytit ja rasvakudos • Hepatosyytit ja maksakudos • Erilaistumattomat kantasolut • Hematopoieettiset kantasolut ja verisolujen tuotto • Somaattiset in vitro solumallit • Ihon fibroblastien käyttö kemikaalien syövyttävyys määrityksiin • Ennen suoritettiin koe-eläimillä

19. Kantasolut toksisuusmäärityksissä • Solujen yleisen stressiasteen mittaaminen toksisuustestauksessa • Simmons et al. 2009;Toxicol. Sci.111(2):202-225 • Solun reagointi stressiin ja siihen liittyvien muutosten määrittäminen • Mahdollistaa integroidun testipaneelin (esim. 10 testiä) kehityksen • Vrt. Yksittäisen spesifisen toiminnan mittaaminen • Menetelmät haastavia • Xenobiootit voi jäädä huomaamtta, koska niiden toksiset vaikutukset on moninaisia ja huonosti tunnettuja • Solun stressiin liittyvät signaalireitit/indikaattorit ollut pitkään tutkimuksen alla • Menetelmien automatisointi mahdollista • Solun stressitilan määrittäminen • Mallina herkät erilaistumattomat kantasolut • Hyvä malli kemiallisten aineiden toksisuusmittauksiin • Mitattavat parametrit: mitokondrion kunto, solun sisäinen ATP-taso, ROS-tasot, Genomisen DNA:n eheys etc.