Estudo da Nefrotoxicidade de Venenos de Serpentes Botrópicas do Nordeste do Brasil

1. Universidade Federal do Ceará Departamento de Análises clínicas- FFOE Laboratório de Cultivo Celular Estudo da Nefrotoxicidade de Venenos de Serpentes Botrópicas do Nordeste do Brasil Gdayllon Cavalcante Meneses

2. Introdução • O Brasil é um país com características climáticas e geográficas muito variadas, possuindo assim uma ampla diversidade biológica. • Pesquisas com toxinas de origem animal apresentam-se como potencial fonte de futuros agentes terapêuticos e têm contribuído muito na compreensão de mecanismos fisiopatológicos de doenças (Mortariet al.2007).

3. Serpentes da fauna brasileira

4. Composição dos venenos de Serpentes

5. Fosfolipases A2Classificação: (Ownby, 1999; Lomonte, 2003).

6. Envenenamentos por Serpentes Botrópicas • As características importantes são sério dano muscular, hemorragia e coagulopatia; • A insuficiência renal, insuficiência respiratória e choque podem ocorrer nos casos mais graves (Bjarnason; Fox, 1994; Kamigutiet al., 1996; Gutiérrez, 2002; White, 2005); • A etiopatogenia da lesão renal tem sido atribuída à nefrotoxicidade direta da peçonha, miólise, hemólise, hipotensão, coagulação capilar glomerular, ação tóxica vascular e até mesmo reações de hipersensibilidade à toxina ou ao soro antiofídico (Pinho et al., 2000).

7. Justificativa • Os acidentes ofídicos representam um sério problema de saúde pública nos países tropicais, pela frequência com que ocorrem e pela morbimortalidade que ocasionam (Pinho et al., 2000); • O gênero Bothropspossui ampla distribuição e corresponde ao grupo de serpentes peçonhentas mais importantes em número de espécies e densidade populacional (Queiroz et al., 2008); • A importância fisiológica do rim e a patogênese da IRA;

8. Justificativa • Quanto a linhagem de células MDCK e mesangiais; • A resposta a injúrias de células tubulares renais; • Qual a importância do estudo do mecanismo apoptótico?

9. Objetivo Geral • Avaliar os efeitos dos venenos das serpentes B. erythromelas,Bothropsinsularise suas frações fosfolipase A2 sobre linhagens de células renais, podendo contribuir para a descoberta de ferramentas farmacológicas e/ou elucidar os mecanismos de nefrotoxicidade.

10. Objetivos específicos • Estudar o efeito dos venenos e frações das serpentes Bothropserythromelas, Bothropsinsularis e suas frações fosfolipase A2em células mesangiais e tubulares renais; • Determinar o efeito dos venenos e frações sobre a viabilidade e proliferação das linhagens celulares em estudo;

11. Objetivos específicos • Avaliar o potencial apoptótico do veneno e suas frações; • Investigar a expressão das proteínas pró-apoptóticas (FAS, Bax e caspase 3) e anti-apoptóticas (BclxL) em células renais; • Investigar os possíveis mediadores envolvidos no efeito renal.

12. Metodologia • CULTIVO CELULAR (MDCK): • Meio de cultura RPMI 1640 + 10% de SBF; • 100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina; • Serão mantidas a uma temperatura de 37 ºC em estufa contendo 5% de CO2 .

13. Metodologia • CULTIVO CELULAR (Mesangiais): • Meio de cultura RPMI 1640 + 20% de SBF + 2% de glicose; • 100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina; • Serão mantidas a uma temperatura de 37 ºC em estufa contendo 5% de CO2 .

14. Metodologia • Armazenar em meio sem SBF por 24h para a obtenção de células na fase G0 do ciclo celular; • Retirar as células das garrafas utilizando tripsina-EDTA; • As células serão então quantificadas em câmara de Neubauer e subcultivadas (1-2x105céls/ml) permitindo o crescimento confluente por 24h.

15. Metodologia Ensaios de Viabilidade e Proliferação Celulares • MTT; • LactatoDesidrogenase;

16. MTT Leitura em espectrofotômetro

17. LactatoDesidrogenase • Avaliar a integridade de membrana no processo de morte celular; • Análise da liberação da enzima LDH, através da sua atividade enzimática.

18. Avaliação da morte celular por apoptose • Detecção da Externalização de Fosfatidilserina; • Determinação do potencial transmembrânico mitocondrial; • Isolamento de RNA total; • Reação de Transcriptase reversa; • Reação em cadeia de polimerase (PCR); • Eletroforese em gel de agarose.

19. Detecção da Externalização de Fosfatidilserina • Novas descobertas do processo apoptótico estão surgindo com a descoberta de novos parâmetros, Um deles é a dosagem de fosfatidilserina (PS); • Mudanças na estrutura da membrana plasmática como forma de sinalização; • A Anexina V é uma proteína de ligação para fosfolipídeos que pertence a família das Anexinas. Na presença de íons de cálcio ela exibe alta afinidade para a ligação seletiva a fosfatidilserina.

20. Determinação do potencial transmembrânicomitocondrial • Rodamina é um nome genérico para uma família de compostos orgânicos, corantes chamados fluoronas; • A rodamina-123 (Rh-123) é um fluorocromo específico para a marcação mitocondrial em células vivas; • Alterações ao nível da integridade mitocondrial podem ser detectadas através do aumento da fluorescência verde citosólica, indiciando uma difusão da Rh-123 da mitocôndria para o citosol(Johnson et al., 1980).

21. Isolamento de RNA Total • Serão isolados utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo o protocolo descrito pelo fabricante:

22. Reação em cadeia de Polimerase • Extração do RNA Total feita para a formação do cDNA na reação de Transcriptase Reversa; • É feita então a ampificação do cDNA; • Analisar a expressão gênica dos diversos mediadores celulares pró-apoptóticos(FAS, Bax e caspase 3) e anti-apoptóticos (BclxL) .

23. Eletroforese em Gel de Agarose

24. Determinação de mediadores em cultura de células renais • Determinação de nitrito; • Determinação de TNF-α; • Qual a importância da determinação desses mediadores?

25. Análise estatística • Serão realizados três experimentos independentes, em triplicata, para cada ensaio. • As médias obtidas em cada experimento serão comparadas utilizando o teste t ou ANOVA, seguido do teste de Bonferroni, quando apropriado, usando o software PrismGraphPad versão 5.0. Valores de p < 0,05 serão considerados para a análise.

26. OBRIGADO!