Spectroscopie infrarouge impulsionnelle appliquée au transfert de ligands dans les hémoprotéines

1. Thèse Présentée par Thomas Polack Spectroscopie infrarouge impulsionnelle appliquée au transfert de ligands dans les hémoprotéines préparée au Laboratoire d’Optique et Biosciences Directrice de thèse Antigoni Alexandrou

2. Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Différentes approches expérimentales • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions et Perspectives

3. Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Approches expérimentales • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions et Perspectives

4. F. Schotte, M. Lim, T. A. Jackson, A. V. Smirnov, J. Soman, J. S. Olson, G. N. Phillips Jr., M. Wulff, P. Anfinrud, Science 300, 1944 (2003). Transfert de ligands • Transport, stockage, catalyse • enzymatique, détection de ligands • Liaison du ligand à l’hème • → fonction de la protéine • Dynamique du transfert du ligand • site de liaison ↔ extérieur • Sonder le transfert : • rayons X • absorption transitoire visible • → transitions électroniques de l’hème • absorption transitoire infrarouge • →vibration du ligand

5. Motivations • Compréhension du processus de transfert entre la poche de l’hème et l’extérieur de la protéine • → Premières étapes du transfert • Accès aux caractéristiques vibrationnelles du ligand aux temps courts • Détection du champ émis : intervention de mouvements concertés dans le processus de transfert

6. Myoglobine : de l’hème au docking-site Olson et al. Biochemistry (1994) Elber et al. Biophys. J. (1998) B1 O Côté distal C Transfert Côté proximal CO au docking-site CO lié à l’hème Dissociation déclenchée par une impulsion pompe visible dans la bande de Soret à 400 nm.

7. Caractéristiques infrarouges du transfert Δα CO lié à l’hème • Ligand CO • Vibration en dehors du continuum des autres modes • vibrationnels de la protéine • Forte absorption • Modification de la vibration • 1945 → 2130 cm-1 • Diminution force d’oscillateur • d’un facteur 30 • Changement d’orientation • Temps de déphasage ~1ps Anfinrud et al. J. Chem. Phys. (1995) CO sur le docking-site Δα ┴ ║ B2 B1 Anfinrud et al., Nat. Struct. Biol. (1997)

8. M. Joffre et al. Opt. Lett. 1988. Effets de polarisation perturbée Domaine temporel • T2 ~1ps • Délai pompe-sonde négatif • Polarisation perturbée • par la pompe • Oscillations spectrales • Dynamique aux temps courts Polarisation P DP Polarisation perturbée par la pompe Domaine spectral • Transmission différentielle • intégrées spectralement • → signal faible • Détection du champ émis

9. Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Approches expérimentales • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions et Perspectives

10. Montage expérimental 10 W Verdi OPA 6 µJ 4 µJ 4 µJ 1.2-2.4 µm RegA RegA RegA BBO 100 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs BBO 100 nJ Coherent Coherent Coherent Regen. Amp. Regen. Amp. Amplificateur Régénératif 800 nm, 5 nJ Vitesse Mira Mira Signal 80 MHz, 100 fs Coherent Coherent Coherent BBO l/2 Pompe 400 nm 200 fs 250 nJ Idler Oscillateur Oscillator Oscillator Délai pompe-sonde Ds = 100 cm-1 IR AgGaS2 Différence de fréquence 3-18 µm, 250 fs, 40 pJ Détecteur HgCdTe Interféromètre Translation-Rotation de l’échantillon

11. Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Approches expérimentales • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions et Perspectives

12. Premiers résultats expérimentaux 4 5 D T/T x 10 3.5 • Intégration spectrale • Faible signal 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Nécessité d’améliorer du rapport signal à bruit 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Délai pompe-sonde (ps)

13. Montage expérimental 10 W Verdi OPA 4 µJ 4 µJ 6 µJ 1.2-2.4 µm RegA RegA RegA BBO 100 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs BBO 100 nJ Coherent Coherent Coherent Regen. Amp. Regen. Amp. Amplificateur Régénératif 800 nm, 5 nJ Vitesse Mira Mira Signal 80 MHz, 100 fs Coherent Coherent Coherent Pompe 400 nm 200 fs 250 nJ BBO l/2 Idler Oscillateur Oscillator Oscillator Délai pompe-sonde IR AgGaS2 Détecteur HgCdTe Interféromètre Translation- Rotation de l’échantillon

14. Détection différentielle infrarouge Laser (100 kHz) • Hacheur mécanique haute fréquence • Intensité de référence Faisceau pompe 50 kHz Intensité de référence AgGaS2 IR Détection synchrone Détecteur HgCdTe Echantillon Intensité sonde transmise

15. Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Approches expérimentales • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions

16. 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 Sondes Infrarouges et absorption du ligand 2 1 3 Intensité (unités arbitraires) CO lié à l’hème CO sur le docking site Sonde Ds = 100 cm-1 Nombre d’onde 2130 cm-1 1945 nombre d’onde ( cm-1)

17. 2 1 3 -4 x 10 1945 2130 Transmission différentielle dans MbCO 1.5 Fréquence finale 2120 cm-1 -ΔT/T 1 ║ 0.5 0 Fréquence intermédiaire 2060 cm-1 ║ -0.5 Aucun signal observé dans deoxymyoglobine -1 -1.5 Fréquence initiale 1945 cm-1 ┴ -2 Pompe 400 nm Sonde IR -1500 -1000 -500 500 1000 1500 2000 0 Délai pompe-sonde (fs)

18. -4 Fréquence finale Fréquence initiale Absorption différentielle Angle Magique Pompe 400 nm Sonde IR

19. Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Approches expérimentales • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions

20. 1900 2000 2100 2200 Nombre d’onde (cm-1) Simulations • Modèle Phénoménologique : • Polarisation induite • linéairement par la sonde • Modèle à 2 niveaux • équations de Bloch • Variation • fréquence • force d’oscillateur • temps de déphasage • orientation

21. -4 Expérience Simulation Changement instantané de force d’oscillateur D Fréquence finale Fréquence initiale → Changement abrupt de la force d’oscillateur n’est pas compatible avec l’expérience

22. -4 Expérience Simulation Changement progressif de force d’oscillateur D Fréquence finale Fréquence initiale → Temps caractéristique de la diminution de la force d’oscillateur : 400 fs

23. -4 Expérience Simulation Changement de fréquence vibrationnelle progressif D Fréquence finale Fréquence initiale → Moins bon accord avec les expériences

24. -4 Avec élargissement Sans élargissement Effet d’un élargissement spectral D Fréquence finale Fréquence initiale → Influence faible pour un élargissement inférieur à la largeur du spectre de sonde

25. Expériences intégrées spectralement • Changement de fréquence quasi-instantané • Diminution progressive de la force d’oscillateur • Faible influence de l’élargissement spectral • Nouvelle observation • Compatible avec les résultats • de Anfinrud et al • Indicateur de la distance Hème-CO • Nécessité de calculs de force d’oscillateur → Utilisation de la force d’absorption comme sonde du transfert

26. Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Approches expérimentales • Expériences pompe-sonde intégrées spectralement • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions

27. t ET = EI + ER Champ transmis et Champ rayonné ETransmis EIncident Transmission |ET |2 Champ émis ER ERayonné

28. t Eréférence Expériences de détection du champ émis EPOMPE Eexcitation Nécessité d’un contrôle de la phase fref - fexc

29. Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Approches expérimentales • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions

30. Montage expérimental 10 W Verdi OPA 4 µJ 4 µJ 6 µJ 1.2-2.4 µm RegA RegA RegA BBO 100 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs 200 kHz, 150 fs BBO 100 nJ Coherent Coherent Coherent Regen. Amp. Regen. Amp. Amplificateur Régénératif 800 nm, 5 nJ Vitesse Mira Mira Signal 80 MHz, 100 fs Coherent Coherent Coherent BBO l/2 Pompe 400 nm 200 fs 250 nJ Idler Oscillateur Oscillator Oscillator Délai pompe-sonde IR AgGaS2 Détecteur HgCdTe Interféromètre Translation-Rotation de l’échantillon

31. Montage expérimental t t AgGaS2 échantillon AgGaS2 • Deux générations IR • Phase relative difficile à stabiliser Détecteur HgCdTe Modification de la configuration expérimentale

32. fpompe HeNe PZT fexcitation Microcontrôleur Détection synchrone Montage expérimental AgGaS2 échantillon Détecteur HgCdTe • Impulsion de référence engendrée dans le même cristal • Interferomètre asservi → Impulsions vérrouillées en phase • Détection synchrone à la somme de fréquence fpompe + fexcitation • Impulsion de référence engendrée dans le même cristal • Impulsion de référence engendrée dans le même cristal • Interferomètre asservi → Impulsions vérouillées en phase

33. Dt Df = w0Dt Df = 0 Df = p/2 t Deux approches possibles Détection homodyne référencée j t Détection homodyne auto-référencée d - w0t → facilité de mise en oeuvre

34. Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Approches expérimentales • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions et Perspectives

35. Expériences de détection du champ émis Expérience de détection du champ émis pompe pompe • Changement avec la phase • Contribution pompe-sonde • Impulsion excitatrice excitation excitation référence référence 500 fs t t

36. Plan de la présentation • Transfert de ligands dans les hémoprotéines • Approches expérimentales • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Résultats expérimentaux • Analyse et Interprétation • Détection du champ émis • Mise en oeuvre • Expérience • Conclusions et Perspectives

37. Conclusions • Expériences pompe-sonde spectralement intégrées • Mesure l’absorption intégrée et le décalage en fréquence • Expérience adaptée aux grands changements de fréquence > 100 cm-1 (myoglobine) • Mise en évidence d’une décroissance non-instantanée de la force d’oscillateur, c’est une nouvelle observation • Utilisation de cette force d’oscillateur comme sonde du transfert • Expériences de détection du champ émis • Démonstration expérimentale • Expérience adaptée aux faibles changements de fréquence et transfert cohérent

38. Perspectives • Etude du transfert de ligand dans diverses hémoprotéines à l’aide des méthodes développées • Expérience de détection du champ émis dans la cytochrome c oxydase Ursula Liebl and Gérard Lipowski and Michel Négrerie and Jean-Christophe Lambry and Jean-Louis Martin and Marten H. Vos, Nature 401 (1999) nFe=1962 cm-1 → nCu=2062 cm-1