K. pneumoniae productrice de BLSE isol e dans les h pitaux de Annaba

1. K. pneumoniae productrice de BLSE isolée dans les hôpitaux de Annaba

2. Introduction 1.Bactériologie de l'espèce K.pneumoniae 2.Résistance de K.pneumoniae aux antibiotiques 3.Les bêta-lactamases 4.Environnement hospitalier et K.pneumomiae 5.Infections nosocomiales à K.pneumoniae 6.Isolement et identification biochimique des souches de K.pneumoniae 7.Tests de sensibilité aux antibiotiques 8.Tests de détection de BLSE 9.Etude de l'incrimination des souches de K.pneumoniae isolées de l'environnement hospitalier dans les infections nosocomiales observées Conclusion

3. La résistance bactérienne aux antibiotiques a augmenté avec des proportions inquiétantes ces dernières années et est devenue un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale, mettant en jeu la validité de l’arsenal thérapeutique. Cette résistance bactérienne est la résultante d’interactions complexes entre la bactérie d’une part et en son environnement d’autre part. Elle est liée essentiellement à un usage excessif des antibiotiques Les bêta-lactamines sont des antibiotiques largement prescrits, seuls ou en association avec d'autres antibiotiques, en pathologie hospitalière. La résistance acquise vis-à-vis de ces antibiotiques peut être :par efflux actif de l'antibiotique, par imperméabilité membranaire ou par inactivation enzymatique ce mécanisme d'inactivation enzymatique est lié à la production d’une bêta-lactamase décrite initialement chez l'espèce K.pneumoniae . L’objectif de notre travail est : Rechercher les souches de K.pneumoniae chez des patients hospitalisés et dans leur environnement afin d’estimer la relation entre les deux réservoirs, Détecter parmi celles-ci les souches productrices de bêta-lactamases à spectre étendu Evaluer l’état de résistance de ces souches pathogènes responsables d’infections hospitaliéres.

4. 1. Bactériologie de l’espèce K.pneumoniae   Klebsiella pneumoniae appartient au genre Klebsiella et à la famille des enterobactériacae, le genre Klebsiella fait partie du groupe KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia) qui est d’une grande importance en clinique hospitalière, a longtemps été considéré comme commensale, rarement pathogène. Le genre Klebsiella comporte actuellement cinq espèces : Klebsiella pneumoniae comportant trois sous espèces : K.pneumoniae subsp.pneumoniae K.pneumoniae subsp.ozaneae K.pneumoniae subsp.rhinoscléromatis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola

5. K.pneumoniae est un bacille à Gram négatif de 1 à 2 µm de long sur 0.5µm de large toujours immobile asporulé très souvent encapsulé regroupé en diplobacilles ou en courtes chaînettes se développe en aéro-anaérobiose et forme sur les milieux classiques d’isolement pour entérobactéries des colonies lactose positives .

6. 2. Résistance de K.pneumoniae aux antibiotiques  Résistance naturelle  Résistante aux pénicillines (amoxicilline, ticarcilline) :une bêta-lactamase de de type SHV (SHV-1). Résistance acquise Résistance aux inhibiteurs de bêta-lactamases : bêta-lactamases de type TRI Résistance au cefépime et cefpirome :par la combinaison de deux mécanismes : la production à haut niveau d’une BLSE de type SHV-5 et une diminution de la perméabilité de la membrane externe. Résistance à un large spectre de bêta-lactamines, notamment aux C3G :.des bêta-lactamases plasmidiques de classe C d’Ambler . Résistance à l’imipenéme due à l’association d’une imperméabilité de la membrane externe et une production à haut niveau d’une bêta-lactamase plasmidique de classe C d’Ambler. Résistance à l’imipenéme et à la ceftazidime :une metallo-bêta-lactamase (IMP) sur une structure de type intégron. Résistance à toutes les bêta-lactamines ,sauf les cephamycines(cefoxitine et cefotetan) et les carbapenémes(imipenéme et meropenéme) :BLSE

7. 3. Les bêta-lactamases  3.1 Définition Les bêta-lactamases sont des enzymes qui inactivent le noyau bêta-lactame structure de base des bêta-lactamines . Les bêta-lactamases sont classées selon leurs niveau d’action sur leurs substats en: les penicillinases les cephalosporinases les bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE). 3.2. Définition des BLSE  Ceux sont des bêta- lactamases dites à spectre étendu capables d’inactiver des cephalosporines de toisiéme génération(C3G)

8. 3.3. Caractéristiques des bêta-lactamases  Tableau I : Principales caractéristiques des bêta-lactamases

9. .3. 4 Terminologie des BLSE  La terminologie des BLSE se réfère soit : Au phénotype de résistance, qui tient compte de l’inactivation du substrat type ; les BLSE sont alors dénommées : Type cefotaximases : telles que CTX-1 (TEM-3), SHV-2 ou SHV-3 ou; Type ceftazidimases : telles que CAZ-5 (SHV-4), CAZ-4 (SHV-5) ou CAZ-6(TEM-24). A l’origine des enzymes dérivés de TEM ou de SHV, dont les groupes de variants sont différenciés par des indices numériques donnant ainsi des dénominations synonymes ; exemple SHV-2 et TEM-1.

10. 4. Environnement hospitalier et K.pneumoniae L’environnement hospitalier comportant les éléments suivant : air, eau ,linge, aliments, dispositifs médicaux ,déchets et surface,constitue un réservoir de micro-organismes. Différents sites de K.pneumoniae K.pneumoniae se trouve généralement au niveau : des sanitaires, des fleurs, du sol, du dossier du malade des surfaces du bloc opératoire , des liquides contaminés tels que les solutions antiseptiques et l’eau utilisée pour l’hémodialyse . des dispositifs médicaux imparfaitement désinfectés ou stérilisés, (certaines radiographies) sur les blouses et mains du personnel soignant.

11. 5. Infections nosocomiales à K.pneumoniae K.pneumoniae est responsable d’infections nosocomiales dont les plus habituelles sont : Les infections urinaires : 40% le principal risque est le catherisme des voies urinaires. Les infections post-opératoires: 20% la fréquence de l’isolement de K.pneumoniae dans les sites opératoires est de 5.6%. Les infections respiratoires : 15% les pneumonies à K.pneumoniae représentent 13.2%. Bactériémies 4.1% .

12. Notre enquête multicentrique réalisée au niveau des différents services des CHU de la ville d'Annaba (CHU Dorban, CHU Ibn Rochd et CHU Ibn Sina) a porté sur l’isolement de l’espèce K.pneumoniae dans l’environnement hospitalier. 500 prélèvements 250 Prélèvements 250 Prélèvements de d’origine pathologique l'environnement hospitalier

13. 6.Isolement et identification biochimique des souches de K.pneumoniae - L'isolement a été effectué sur les milieux les plus utilisés pour l’isolement des entérobactéries tel que le milieu Mac Conkey et le milieu Hektoen. L’identification biochimique Galerie biochimique classique Système API 20E

14. L'étude du comportement des souches de K.pneumoniae isolées vis-à-vis des antibiotiques utilisés pour entérobactéries a été réalisée par la méthode des disques en milieu solide selon la NCCLS.

15. L'utilisation de la galerie biochimique classique a montrée que : Toutes les souches sont immobiles et utilisent le citrate, et fermentent le glucose, le lactose et le saccharose ainsi que le mannitol comme source de carbone et d'énergies 90% des souches utilisent la voie butanoleïque pour attaquer le glucose (réaction de Voges Proskawer). Elles réduisent les nitrates en nitrites par progression de nitrate réductase et d'autres dépassent le stade nitrites en azote moléculaire. L'utilisation de l'urée comme source d'azote est observée chez 60% des souches. Toutes les souches sont dépourvues de l'ornithine décarboxylase par contre pour la plus part elles possèdent la lysine décarboxylase.

16. A partir de 500 prélèvements 100 souches de k.pneumoniae ont été identifiées: 80 souches (prélèvements d’origine pathologique ). 20 souches ( prélèvements de l'environnement hospitalier).

17. Nous remarquons : des souches appartennant au phénotype sauvage; sensibles à tous les antibiotiques utilisés à l'exception des résistances naturelles((l'ampicilline et l'amoxicilline) présentées dans l'antibiotype 3. 04% d'entre elles sont de phénotype imipenéme résistant (antibiotype 1) l'existence du phénotype BLSE présenté dans l'antibiotype 2. L'existence d'une sensibilité à l'ampicilline chez 2 souches (antibiotype4). Le reste de souches sont de phénotypes indéterminés, notons aussi la résistance seule aux aminosides.

19. 8.1. Test de synergie Principe  Le test consiste à rechercher une image de synergie entre un disque d'antibiotique contenant un inhibiteur de bêta-lactamase et un disque de cephalosporines de troisième génération (ceftriaxone, ceftazidime et cefotaxime) ou un monobactame (aztréonam).Cette image dite en "bouchon de champagne" Technique -Préparation de l’inoculum -Ensemencement d’une gélose MH selon la NCCLS -Placer deux disques:un disque d’AMC et un disque de C3G sur les boites de Pétri(voir figure) -Incubation pendant 18 heurs à 37°c

20. Lecture

21. Faux positif La synergie existe mais elle ne correspond pas à une BLSE, Elle peut être due à une hyperproduction d'une bêta-lactamase naturelle Faux négatif L'image de synergie est absente, la production de BLSE sera suspectée devant toute diminution de diamètre autour des céphalosporines de troisième génération ou des monobactames CTX = 27 mm, CAZ = 22 mm, CRO = 25 mm, ATM = 27 mm. Le faux négatif s'observe : Chez les souches qui possèdent deux mécanismes de résistance aux bêta-lactamines, une BLSE et une hyperproduction d'une bêta-lactamase naturelle, Lors La mauvaise expression de bêta-lactamases c'est à dire synergie faible

22. Résultats: Tableau III: Test de synergie pour 100 souches de K.pneumoniae

24. 8.2. Tests complémentaires: 8.2.1 Test à la cloxacilline Principe La cloxacilline ajoutée en milieu Müeller-Hinton inhibe in vitro très fortement toutes les céphalosporinases de la classe A d'Ambler, on constate en comparant l'antibiogramme standard et l'antibiogramme avec la cloxacilline une restauration de l'activité de certains antibiotiques inhibés par les céphalosporinases (C3G, C2G voir C1G). Technique Même technique que le test de synergie Lecture L'interprétation des résultats peut se traduire, en comparant les boites de Pétri contenant une gélose Müeller-Hinton simple et celles contenant les géloses supplémentées de la cloxacilline, selon les cas suivants : Restauration complète de l'activité des bêta-lactamines: présence d'une céphalosporinase. Restauration de l'activité de C3G, des associations bêta-lactamines inhibiteur de bêta-lactamase sans image de synergie C3G/ AMC en "bouchon de champagne", mais inactivité des C1G (+ - / C2G), des amino- et carboxy-pénicillines présence d'une céphalosporinase hyperproduite + pénicillinase, Idem avec image de synergie: BLSE+ céphalosporinase. Pas de restauration, pas d'images de synergie: pénicillinase de haut niveau,

25. Lecture La restauration de l'activité du C3G ou monobactam utilisé est traduite par l'apparition de l'image de synergie(en bouchon de champagne)entre C3G/ AMC.

28. 8.2.2. Test du rapprochement des disques Principe Lorsqu'un second mécanisme de résistance est susceptible de masquer le présence l'image de BLSE, il est possible de retrouver cette image de synergie en rapprochant du disque contenant l'acide clavulanique les disques de céphalosporine de troisième génération ou d'aztréonam (15 ou 20 mm centre à centre) Technique -procéder de la même manière que le test de synergie dans la préparation de l’inoculum et l’ensemencement. -placer les disques d’antibiotiques(C3G ) À différentes distances du disque(AMC) sur les boites de Pétri selon la figure -incubation pendant 18 heurs à 37°c.

31. 8.3. Test du double disque : (appelé aussi test espagnol) Principe Ce test consiste à rechercher une augmentation de la zone d'inhibition d'un disque de C3G, précédé par l'application d'un disque contenant l'AMC, comparé à un autre disque portant la même céphalosporine et placé côte à côte sur la gélose M-H Technique -Procéder de la même manière que le test de synergie dans la préparation de l’inoculum et l’ensemencement -Placer deux disques d’antibiotiques : un disque d’AMC et un disque deC3G selon la figure -laisser diffuser à la température ambiante du laboratoire pendant une heure de temps. -Remplacer le disque d’AMC par un disque deC3G -incuber pendant 18 h à 37°c Figure 3: Schéma de détection des BLSE par le test espagnol

32. Lecture Le test est considéré positif si le diamètre de la zone d'inhibition du disque de céphalosporine de troisième génération est inférieur de 4 à 5 mm comparé à celui observé autour du disque de céphalosporine de 3ème génération appliqué après pré-diffusion du disque de l'AMC.

35.  Détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) La CMI de l'antibiotique sur la souche étudiée est définie comme la plus faible concentration inhibant, après 18 à 24 heures de contact à 37°C, toute croissance bactérienne invisible à l'œil nu .

37. 8.2. Détermination du phénotype de résistance des BLSE Principe La détermination des phénotypes de la BLSE se fait par la détection des substrats préférentiels de cette enzyme. Elle se réalise en recherchant les éventuelles images de synergie en bouchon de champagne qui peuvent paraître, sur la gélose, entre les disques de bêta-lactamines. Procéder de la même manière que le test de synergie dans la préparation de l’inoculum et l’ensemencement. Placer les disques d’antibiotiques (C3G,AMC) selon la figure. Incuber pendant 18 h à 37°c

38. Lecture L'interprétation des résultats pour la détection de l'image en "bouchon de champagne" se fait en se référant aux figures correspondants aux différents phénotypes de résistance de la BLSE produite (voir figures). Le phénotype CTX Se caractérise par une augmentation équivalente de la résistance au cefotaxime, à la ceftazidime et à l'aztréonam exemples: TEM-3, TEM-4, TEM-2 (voir figure suivante)

39. Le phénotype CAZa Le niveau de résistance à la ceftazidime est plus important que celui du cefotaxime et de l'aztreonam exemple: TEM-12, TEM-7, SHV-6(voir figure suivante)

40. Le phénotype ATM Se caractérise par une résistance contre le disque d'aztréonam avec des diamètres supérieurs à 20mm pour la ceftazidime et le cefotaxime Exemple : TEM-22 (voir figure suivante) Le phénotype TEM-20 Se caractérise par une légère augmentation de la résistance au cefotaxime, la ceftazidime et l'aztréonam étant peu touchés (voir figure suivante).

41. TableauVII: phénotypes de résistance des 35 souches kp BLSE

45. 9. Etude de l'incrimination des souches de K.pneumoniae isolées de l'environnement hospitalier dans les infections nosocomiales observées L'expression phénotypique concerne : Les antibiotypes pour l’ensemble des souches de K.pneumoniae isolées Les phénotypes des BLSE pour les souches KpBLSE.

47. Ce travail nous a permis d’avoir une idée sur l’ambiance hygiénique qui règne dans nos milieux hospitaliers, ce ci dit le manque d’hygiène potentialise le rôle du réservoir environnemental dans les infections nosocomiales à K.pneumoniae, ces hôpitaux ne constituent plus un champ d’asepsie privilégié puisque y circulent des malades porteurs de souches de K.pneumoniae productrices de BLSE(des BMR) La lutte efficace contre l’émergence de la dissémination des résistances, appelle les compétences du monde médical dans son ensemble: Celles du médecin clinicien qui par sa prescription rationnelle assurera un succès et évitera la sélection de mutants résistants ; Celles du microbiologiste qui devra diagnostiquer les résistances de bas niveau mais potentiellement redoutables ; Celles de l’équipe du contrôle de l’infection qui prendra les mesures à prendre pour diminuer la dissémination des souches résistantes.