Bioķīmija II Proteīnu analīzes metodes. Proteīnu raksturošana. Proteīnu sekvenēšana

1. Bioķīmija II Proteīnu analīzes metodes. Proteīnu raksturošana. Proteīnu sekvenēšana Pamatliteratūra: Principles and Techniques of Practical Biochemistry. Eds. K.Vilson and J.Walker. Cambridge Univ.Press, 2000,874 p.(1-80 lpp.) LU Bioloģijas Fakultātes Molekulārās bioloģijas (bioķīmijas ) katedra . 2012/13. akad.gads

2. Proteīnus tīrot jālieto metožu komplekss Piemērs: Transketolāzes attīrīšana Attīrīšanas stadija Kop.tilp.Kop.olb.Kop.akt.vien. Īpatn.akt.Attīrīš.pak. Iznākums (metode) ml mg Vien. Vien./mg % Rauga ekstrakts 104 1350 10,6 0,008 - 100 Frakcionēta 15 630 7,6 0,012 1,5 71 izgulsnēšana ar 45-75% piesātinājuma amonija sulfātu Jonapmaiņas 72 50 7,0 0,14 17,5 66 hromatogrāfija uz DEAE-sefadeksa A-25 Adsorbcjas 14 4 5,9 1,5 188 56 hromatogrāfija uz hidroksīlapatīta

3. Proteīnu tīrības pārbaudes I. Hromatografijā “simetriska” frakcija II. Elektroforēzes metodes: 1) poliakrīlamīda gēlā 5-30% a) natīvā buferētā gelā b) 5-20% gradienta gelā c) denaturējošos apstākļos: Lemmlī šķīdums = 5%merkaptoetanols 2% dodecīlsulfātaCH3(CH2)10CH2- O - SO3-Na+ 2) izoelektrofokusēšana (amfolīni) 3) kapilārelektroforēze 4) divdimensionalā elektroforēze III. Molmasas noteikšana: 1) gēlfiltrācija 2) masas spektrometrija IV. C- un N- gala aminoskābju noteikšana V. Primārās struktūras noskaidrošana

4. Arnes Tiseliusa elektroforēzes iekārta un Nobela balvas ieguvēja diploms, Upsalas Universitātes muzejā

5. Proteīnu analīzes metodes 1. Summārais aminoskābju sastāvs 2. C- un N- galu aminoskābes 3. Molmasas noteikšana 4. Ierobežota šķelšana a)enzimātiski b)ķīmiski 5. Peptīdu analīzes (peptīdu fingerprints) 6. Sekvences analīzes 7. Konformācijas pētījumi a) rentgenstruktūranalīze b) divdimensionālā kodolu magnētiskās rezonanses spektroskopija c) optikās rotācijas dispersija d) imunoanalīzes 8. Proteīnu iezīmēšana - jods,rodamīns,enzīmi

6. Proteīnu analīzes metodes 1. Summārā aminoskābju sastāva noteikšana: 1. Hidrolīze ar 6 N HCl, 100-120oC , 10-24 st , iegūst aminoskābju hlorīdus: R-CH- COOH , sašķeļas Gln Glu un Asn Asp NH3+ Cl- 2. Aminoskābes sorbē uz katjonīta - sulfonēta polistirola, karboksimetīl … 3. Eluē ar pH gradientu 3,0-5,3 un NaCl 0,2-0,35 N 4. Eluātā aminoskābas detektē ar ninhidrīna krāsu reakciju. Nevar detektēt prolīnu, jo tas nedod šo krāsu reakciju

7. Uz katjonīta sorbējot skābo hidrolizātu, visstiprāk saistīsies bāziskās aminoskābes (Arg) , bet visvājāk skābās (Asp)

8. Natriurētisko peptīdu grupas ANF satur daudz arginīnus, bet tajā nav lizīna un triptofāna

9. Preparāta summārā aminoskābju sastāva noskaidrošana

10. Preparāta summārā aminoskābju sastāva noskaidrošana ANF vajadzētu saturēt: Asp -1 Leu - 2 Asn -1 Tyr - 1 Ser -5 Phe -2 Glu -0 Arg -5 Gln -1 Met - 1 Gly -5 Ala - 1 Ile - 1

11. Proteīnu analīzes metodes 2. N- gala aminoskābju noteikšana: 1. Sangera reaktīvs - Fluordinitrobenzols 2. Edmana reakcija - Fenīlizotiocianāts 3. Dansilhlorīds - Dimetil-aminonaftalīn-sulfonīlhlorīds 4. Šiffa bāze - Reakcija ar aldehīdiem 5. Ninhidrīna reakcija - 1,2,3-indāntriona hidrāts 6. Aminopeptidāzes

12. Proteīnu analīzes metodes 2. C- gala aminoskābju noteikšana: 1. Reducēšana ar borhidrīdu NaBH4 2. Akabori hidrazinolīze NH2 - NH2 3. Karboksipetidāzes

13. Proteīnu analīzes metodes 3. Molmasas noteikšana - molmasa Da un relatīvā molmasa Mr 1. Dodecīlsulfāta (SDS)- poliakīlamīda gēla gelektrofoēze 7-30% gēli,gradienta gēli Denaturējošie apsākļi - 2% SDS , 5%  - merkaptoetanols Daudzums līdz 1 ng, bet uz celiņa ~ 10 mkl, 1 mkg Precizitāte - 5-10% 2. Gēlfiltrācija 1x30 cm , plūsmas ātrums - 1ml/min Precizitāte - 10% 3. Mass-spektrometrija- MALDI - Matrix-assisted-laser-ionization Kļūda nepārsniedz 0,1%, iespējama sekvenēšana

15. Poliakrīlamīda 12% gēls, bez merkaptoetanola un dodecīlsulfāta, t.i. buferēts gēls

16. Imūnglobulīni pēc šķelšanas ar pepsīnu.12-24% poliakrīlamīda gradienta gels. Imūnglobulīni reducēti ar merkaptoetanolu

17. Molmasas: Glukagons - 3 485Da STI - 21 kDa Albumīns - 67 kDa IgG - 150 kDa IgA - 160 kDa α2makrogl. - 163 kDa IgM - 900 kDa

18. Molmasas: Leu=131 Ser= 105 Ala= 89 Fen=165 Glu= 147 Val= 117 Masspektros: aminoskābes molmasa- ūdens (18) Piem:422-351=71+18= =89

19. Masas spektrometra iekārta

20. Proteīnu analīzes metodes 4. Sekvenēšana: Attīstība - 1953- F.Sangera manuālā sekvenēšana 70- gadi - automātiskie sekvenatori no 80- tiem gadiem- pēc nukleotīdu sekvencēm ~ 2000- masspektrometriski Mērķis šodien: 1. Pēctranslācijas modifikājas 2. Farmakopreparāti (gene enginiered drugs) 3. Evolūcijas jautājumi 4. DNS sekvenēšanas apstiprinājums

21. Klasiskās sekvenēšanas etapi

22. Proteīnu analīzes metodes 5. Sekvenēšanas etapi: 1. Ierobežota šķelšana - a) restrikcijas proteināzes Tripsīns Lys- X Arg- X Himotripsīns Fen- X Stafilokoku endoproteināze - Glu- X Asp- X Pseudomonas aeruginosa endoproteināze - Lys-X Bakteriālais termolizīns X- Fen, Ile, Val, Trp, Met, Ala Pepsīns X- Fen Enterokināze Val-4(Asp)- Lys- X Asins recēšanas Xa Stjuarta faktors, normāli šķeļ protrombīnu Ile-Glu-Gli-Arg-X Trombīns Lei-Gli-Val-Arg-Gli-Pro-Arg-X Tobacco etch virus (TEV) proteināze E-X-X-Y-X-Q-(G/S)

23. Proteīnu analīzes metodes 7. Sekvenēšanas etapi: 1. Ierobežota šķelšana - b) ķīmiski pēc metionīna - cianogēnbromīds pēc triptofāna - bromsukcīnimīds BPNS skatols asparagīna- glicīna saiti - hidroksilamīns 2. Peptīdu kartes- figerprints Peptīdu izolēšana 3. Katra peptīda sekvenēšana ar Edmana metodi 4. Pilnas sekvences “deduktīva” konstruēšana

26. Aparātsjānokalibrēar zināmaskoncentrācijas aminoskābjumaisījumu

27. c) beidzot pirmais cikls !!! Kura iznāk N-gala aminoskābe un vai tā ir īstā?

28. Natriurētisko peptīdu grupas ANF satur daudz arginīnus, bet tajā nav lizīna un triptofāna

29. d)otrais cikls – iznāk leicīns. Redzams, ka nošķelšana no N-gala nav pilnīgisinhrona, jo redzams arīiepriekšējās aminoskābesserīna pīķis

30. e) trešais cikls uzrāda arginīnu... Sekvenēšanu turpinalīdz sinhronitātes defektu dēļ vairs nevar atšķirt nākošo aminoskābi Ser-Lei-Arg...

31. Rentgenstruktūras analīze joprojām ir galvenā metode proteīnu konformācijas pētījumos

32. Fāgs Qβ Kapsīdas modelis Genoma uzbūve Nākošie 6 attēli no J.Rūmnieka, K.Tāra referāta LU 69. zinātniskās konferences molekulārās bioloģijas sekcijas sēdes 2011.g. 16. martā • Mazs, ikosaedriskas simetrijas vīruss, Ø~28nm • Klasificē levivīrusu dzimtā, allolevivīrusu ģintī • Inficē E.coli • Genoms – vienpavediena (+)RNS, 4217 nt • Tikai 4 gēni

33. Kristalizēšana His-A1 proteīns kristalizējās kā plānas plāksnītes

34. Struktūras noteikšana Kristāli difraģēja līdz 1.8Å izšķirtspējai Struktūra tika noteikta, izmantojot divus kristālu smago atomu atvasinājumus (MIRAS metode)

35. Struktūras noteikšana Eksperimentālā karte 3Å izšķirtspējā Galīgā karte 1.8Å izšķirtspējā

36. A1 pagarinājuma struktūra Telpiskā struktūra nelīdzinās citiem zināmiem proteīniem Satur gan β plāksnes, gan vairākas īsas α spirāles N-galā atrodas poliprolīna II spirāle

37. A1 pagarinājuma struktūra

38. Ar divvirziena elektroforēzi var plazmā atrast vairākus simtus proteīnu

39. Tikai shēmā tas izskatās vienkārši un saprotami. Tomēr šodien pasaulē jau aktīvi strādā pie “proteomiks” visu šūnā esošo proteīnu daudzuma un struktūras izpētes

40. Te uzskaitīti visi postulētie “omiksi”

41. Monoklonālās antivielas terapeitiskiem mērķiem analizē šādi ( Amgen, USA) Primārstruktūra: peptīdu kartes ar masas spektrometriju (MS) Q-TOF- masas spektrometriju nereducējošos apstākļos Q-TOF- MS nereducējošos apstākļos deglikozilēti Ogļhidrātu komponents: cukuru profils Lādiņu heterogenitāte: katjonu jonu augstas izšķiršanas spējas (HPLC) hromatogrāfija izoelektrofokusēšana kapilārā Lieluma heterogentiāte: gelfiltrācijas HPLC reducējošos apstākļos SDS kapilārelektroforēze Augstākās struktūras: disulfīdsaišu vietu noteikšana reversās fāzes nereducējoša HPLC Furjē transformēta infrasarkano staru spektroskopija cirkulārais dihroisms ultravioletā diapazonā diferenciālā skannējoša kalorimetrija

42. (Shēma no Roche firmas IMPD)

43. Attēls no Abbas A.K., Lichtman A.H., Pillai S., Cellular and Molecular Immunology, Saunders, 2007

44. Cukuru profili imunoglobulīnos M ~ 1.500-2.000 (glikoze= C6H12O6 = 180) (Shēma no Roche firmas IMPD)