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北京大学生物基础实验教学中心 创新性实验教学项目汇报 2007-12-21

北京大学生物基础实验教学中心 创新性实验教学项目汇报 2007-12-21. 发育生物学实验. 发育相关基因的表达，诱变及其功能研究. 普通生物学实验. 分子生物学实验. 实验教学平台. 分子生物学实验题目（ 1 — 6 ） 题目一 GFP 蛋白的基因克隆及表达. 题目二 EGFP 基因在 pGEX-4T-1 载体中的克隆和表达 构建 EGFP-pGEX 重组质粒 重组质粒的获得、阳性克隆的筛选鉴定、蛋白质表达和分析 PCR 基因扩增、 DNA 的限制性内切酶酶切、 DNA 连接及质粒转化、 DNA 序列分析、蛋白质转移等.

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北京大学生物基础实验教学中心 创新性实验教学项目汇报 2007-12-21

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Presentation Transcript

  1. 北京大学生物基础实验教学中心 创新性实验教学项目汇报 2007-12-21

  2. 发育生物学实验 发育相关基因的表达，诱变及其功能研究

  3. 普通生物学实验

  4. 分子生物学实验

  5. 实验教学平台

  6. 分子生物学实验题目（1—6） 题目一 GFP蛋白的基因克隆及表达

  7. 题目二 EGFP基因在pGEX-4T-1载体中的克隆和表达 • 构建EGFP-pGEX重组质粒 • 重组质粒的获得、阳性克隆的筛选鉴定、蛋白质表达和分析 • PCR基因扩增、DNA的限制性内切酶酶切、DNA连接及质粒转化、DNA序列分析、蛋白质转移等

  8. 题目三 增强型绿色荧光蛋白（EGFP）突变基因在 大肠杆菌中的表达与检测 Expression and detection of site-directed mutagenic EGFP gene in E.coli EGFP的定点突变： 实验目的原理： EGFP家族中的几个成员CFP、YFP等与EGFP有很高的同源性，本实验 利用已有的EGFP序列通过定点突变技术得到CFP、YFP等同源蛋白的DNA序列并对表达产物进行观察与分析。 实验内容： 查找EGFP、CFP、YFP等同源蛋白的碱基序列； 通过碱基序列的对比分析设计引物进行定点突变实验； 筛选阳性突变体并对表达产物进行观察分析。 实验室提供的实验材料：大肠杆菌E.coli菌株DH5α、BL21，质粒pET－28a－EGFP/pEGFP-N3，各种实验器材及实验试剂

  9. 实验中学到用到的实验技术：DNA定点突变技术

  10. 题目四 双报告基因系统的构建及其初步检测 Why this subject is selected? 1.构建双报告基因质粒（Luciferase-GFP）， ★GFP作为信号蛋白，用于定性鉴定， ★Luciferase作为报告蛋白，用于定量检测，做到灵敏、准确的检测生物系统中目的蛋白、核酸等的变化。 2. 优化Touchdown PCR的条件，为分子生物学实验增加了一种选择。 What have I done? ★构建质粒pET 28a-Luciferase ★构建质粒pET 28a-Luciferase-GFP ★重组质粒表达情况的初步鉴定

  11. 题目五 携带报告基因EGFP的温度敏感型表达载体 的构建、 鉴定和表达量的测定 Why this subject is selected? ★对分子生物学教学实验的改进： 温度诱导概念的引入 ★ 诱导方便，精确调控 ★ 适用于多种菌株，缩短实验流程 ★ 酶切效率高，价格便宜 ★EGFP的定量检测 What have I done? ★重组质粒pBV220-EGFP的构建 ★绘制EGFP的浓度-荧光强度的标准工作曲线

  12. 在不同温度下诱导EGFP表达量变化： 定性：SDS-PAGE 定量：用荧光仪测定破碎菌体上清中 EGFP的 荧光强度, 将不同温度下诱导得到的EGFP表达量对温度进行回归，建立数学模型

  13. 题目六 利用重组酵母，以绿色荧光蛋白作为报告基因检测 环境中雌二醇含量 雌二醇与雌激素受体（estrogen receptor）结合后，此复合物会与细胞核染色体上特异调控元件ERE（estrogen response element, ERE）结合并启动下游报告基因的表达。 我们通过一系列实验构建两个质粒 分别将雌激素受体hRE 与 ERE－报告基因（GFP）重组 并转化感受态酵母细胞。这样构建好的酵母细胞株经不同浓度雌二醇诱导作用后, 下游报告基因(GFP)表达量会有雌二醇浓度依赖的剂量效应关系。 我们希望最终能通过检测下游报告基因蛋白质产物的表达量实现对外源雌激素含量的定性/定量监测。

  14. 探究酵母GFP荧光强度与雌二醇诱导浓度的关系 表1 不同浓度雌二醇诱导表达GFP荧光强度 以雌二醇浓度为X轴，GFP荧光强度为Y轴， 绘制曲线。

  15. 进一步改进实验的建议: • 我们很想进一步改进实验，真正的完成一个比较圆满的结局，无奈大实验时间有限。所以如果以后还有人继续进行这个实验的话，可以在我们的基础上进行： • 我们的鉴定只是初步的，继续做这个题目的同学可以先那我们的质粒 去测序，分析以下测序结果，包括是否有突变，特别是移码突变，插入的位置和顺序是否正确。 • 2. 酵母转化中，我觉得酵母感受态浓度低了，酵母菌似乎很少，可以适当多离心一些菌下来，如果可能，最好测一下OD，做到心中有数；因为共转两个质粒效率会降低不少（我们就仅有1个阳性克隆），有时间最好做两次转化，分别转两个质粒，最好尽量多得到一些阳性克隆，可以重复李湘民老师的实验。

  16. 3. 得到阳性酵母菌后，可以先做个蛋白电泳加WESTERN确定一下hER （雌二醇受体）的表达量，这个也可以用老师提供的雌二醇耦连EGFP 的化合物测定；检查了hER的表达量以后，用雌二醇诱导一下，在检查EGFP是否表达，通过这个检查程序，如果出现问题，也能确定问题是否出在表达量上，以及具体是哪个蛋白的表达量。 4.雌二醇诱导浓度可以再多做几个浓度， 包括50，100，500nmol/L， 这样可以更加深入的了解这个系统的信息输入和输出的量级。加入雌二醇前，各管酵母，最好测个OD，确保酵母数量基本一致，以固定非相关参数。 暂时就想到这些，其实深入做下去，题目本身还是有很多可以挖掘和完善的东西，是挺有意思的一个题目。

  17. 学生体会: 尽管大实验只有三周的时间，但是我们全组齐心合作，大家一起认真完成一件事的感觉让时间过的特别充实而有意义， 从选题，到设计，再到自己动手做实验，最后到今天的结题总结，一个看似很小的题目让我们体会到了一个完整的设计方案解决问题的过程，更让我们体验了小组合作的乐趣。 在我们大学的最后一个秋天，能有这样一次难忘的合作经历让我感到很欣慰。

  18. 不当之处请批评指正！ 谢谢！

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