Disposition

1. Disposition • Kort introduktion til Phag f29 • Forsøgsopstilling • Resultater • Perspektiver

2. Bacillus subtilis phage f29 General Bacteriophage • Hovedet / Kapslen er 42 x 54 nm og 1.6 nm tykt • DNA'et er 1.6 nm x 6.6 mm => • DNA'et er pakket tæt

3. Forsøgsopstilling • Starter med en mængde phager med delvist pakket DNA(pakningen er stoppet pga ATP-mangel) • Den løse DNA ende fastgøres til et bead (fanget af optical tweezer) • Phagen fastgøres til et stillestående bead • Det testes at elastisiteten svarer til et enkelt DNA molekyle

4. Forsøg • Konstant kraft: 5 pNBruges til at se hvordan virusen normalt arbejder:- hastighed og pauser • Konstant afstand (Force Clamp)Bruges til at bestemme virusens motoregenskaber:- stallforce og F-V diagrammer • FællesATP koncentrationen var 0.5 mM Data Opløsningen 70 Hz

5. Konstant Kraft 5pN • Overordnede observationer: - Der er uregelmæssigheder i pakningen i form af pauser, store spring på flere mm og fluktuationer større end almindelige brownske bevægelser. • Data (Gennemsnit): Tpakket: 5.5 min SD 0.8 min fpause: 3.1 mm-1 (s = 3.5) TPause= 4.5 s (s = 5.1)‏ • Pauserne:- Korrelation mellem pause frekvensen og pakket DNA er 0.8. Korrelation med pause tiden er 0.1- Fagen fastholder DNA'et under pauserne • Spring:- Af til mister fagen kontakt med DNA'et men det sker kun 1 gang per 7 mm DNA - Pilene markerer pauser - punkterne på grafen består af gennem snit over 100 rå datapunkter

6. Konstant Kraft 5pN Hastighed(% Pakket)‏ • Hastigheden begynder at falde fra ca 50% og frem. • Pakningen fortsætter til 105% af f29 genomlængde • Bemærk- Hastigheder under 30 bp s-1 er sorteret fra for at få et ordenligt gennemsnit.- SD er 10-20 bp s-1 Grå = Enkel måling Rød = Gennemsnit

7. Force Clamp • Kraften stiger linært indtil stall force opnås. • 2 Problemer:- Phagen mister forbindelse til DNA'et- Binding mellem fagen og beaden springer

8. Force Clamp • Øverst: (F-V)- F-V diagramet findes ved at normaliserer med mean stall force og initial velocity • Nederst: (F-V)- Aktivering af Force Clamp ved 2/3 pakket og 1/3 pakket.- Forskellen er 14 pN og kan regnes om til indre krafter.- Hastigheden er direkte påvirket af kraf, selv for små krafter =>Der er mekaniske steps i modsætning til RNA polemerasen

9. Force Clamp • Øverst: (Stall Force)-Stall force er væsenligt højere end andre ca 8x Kinesin og 2x RNApolemerase-Internal Forces er regnet med, også derfor der kunne opnås Stall Force over 65 pN- Beregnet Effektivitet ~ 30% • Nederset: (Internal force)Beregnet via rate(%pakket) og rate(Force)- Der er en klar stigning i Indre krafter fra 50% og frem.

10. Et Hoved af MetalAntager man at DNA'et bliver pakket i hexagonale crystaller giver det et tryk på 6 Mpa. På grund af tykkelsen skal Kapslen derfor have brudstyrke på 100 MPa tilsvarende Aluminium Perspektiver • MEKANISK vs KEMISKHvis der f29 hovedsaglig blev drevet af en mekanisk process skulle bevægelse per ATP være 0.1 nm hvor ensemble studier har vist 0.68 nm. Det kraftafhænige er altså ikke hoved processen. • Let som i ligevægtI modsætning til forventet ser det ud til at f29's arbejde er af samme størrelsesorden som det kræves for at folde DNA. Der går dermed ikke særligt meget Energi til spilde, da f29 kan bruge det lagrede energi i DNA når det skal sendes ind i cellen