Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium

1. Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1

2. Folyadékkromatográfiás állófázisokról ALAK-FORMA IRREGULÁRIS – TÖRMELÉK SZEMCSÉK (POROK) GÖMBSZIMMETRIKUS – SZFEROID SZEMCSÉK SZEMCSEMÉRET >1 m ELOSZLÁS - HATÁROK GAUSSI, vagy ASZIMMETRIKUS ELOSZLÁS, HOMODISZPERZ - HETERO(POLI)-DISZPERZ SZERKEZET HOMOGÉN (TÖMÖR) SZEMCSÉK ADHÉZIÓVAL, vagy KÉMIAILAG KÖTÖTT FELÜLETI RÉTEGEK PORÓZUS (PELLICULÁRIS) FELÜLETI RÉTEGEK TÁGPÓRUSÚ (PORÓZUS, PERFUZÍV) TÖLTETEK TÖMBPOLIMER (MONOLIT) OSZLOPOK … HALMAZÁLLAPOT SZILÁRD (rigid, xerogél) – GÉL (liogél) – FOLYADÉK STABILITÁS NYOMÁS, HŐ, pH, OLDÉKONYSÁG, BAKTERIÁLIS, KÉMIAI

3. A szilikagél felülete H H Vicinális szilanol csoportok O Dezaktivált szilanol csoportok Izolált szilanol csoportok H H H H OH O O OH O O OH OH OH OH Si Si Si Si Si Si Si O Si O Si O Si O O O O O O O O O O O O Szilikagél határfelülete (pH = 2 – 8) Határfelületen nem disszociált szilanol csoportok Szilárd fázis • Szerkezetéről kevés a megbízható információ (a porózus szilikagél termodinamikailag és kinetikailag nem stabil forma - stabil forma a kristályos szerkezet „kvarc”)

4. Fémszennyezések hatása

5. Módosított szilika állófázisok Távtartó Kölcsönható Árnyékoló CH3 CN CH2 Si NH2 Si O CH2 CH2 NO2 CH(OH)-CH2(OH) CH3 C18 …..

6. Módosított szilika állófázisok NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT FÁZISOK (RP) - OH (diol) - C2, -C4, -C8, -C18 - CN (ciano) - C6H5 (fenil) - NO2 (nitro) - etil, - NH2 (amino) - i-propil - N(CH3)2 (dimetil amino) - i-butil

7. Módosított szilika állófázisok

8. Módosított szilika állófázisok Classic ODS Conventional (non-endcapped) Sterically Protected (non-endcapped) Conventional (endcapped) *Savasan hidrolizálhat

9. Normál fázisú folyadékkromatográfia

10. Mikor alkalmazzuk? Apoláris vagy kevésbé poláris vegyületek meghatározására; Hexán oldható vegyületek; Helyzeti izomerek elválasztására. Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) • Állófázisok • Szilikagél (40-50%); • Alumínium-oxid (3-10%); • Királis állófázis (20-25%); • Módosított szilikagél (pl. NH2, CN, NO2, diol stb.). NP: Az álló fázis polárisabb, mint a mozgó fázis

11. Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) Mozgófázisok (eluens) Apolárisabb az állófázisnál Oldja a mintát és ne reagáljon a minta komponensekkel Detektor kompatibilitás Megfelelő tisztaságú (szilárd szennyezők, O2 mentes stb.) Alacsony viszkozitású ( < 1 cP 25C-on) Könnyen beszerezhető, elfogadható áron Biztonságos (CCl4 benzol stb. egészségre káros) Könnyen keveredő Forrpont (nem túl alacsony buborékképződés miatt)

12. A leggyakrabban alkalmazott folyadékkromatográfiás módszer (elválasztások 80%-a); Fordított fázisú folyadékkromatográfia (RP) • Állófázisok • Szilikagél alapú; (80-90%) (pH = 28); • Szerves polimer alapú; (5-10%) (pH = 114); • Egyéb (szén alapú, zeolit, alumínium-oxid alapú stb.; 2-10%) RP: az álló fázis apolárisabb mint a mozgó fázis

13. Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok Eluenserősség Elúciós erő Víz< Metanol<Acetonitril<Etanol<Izopropanol<Tetrahidrofurán Szelektivitás

14. Fordított fázisú folyadékkromatográfia pKa+2 pKa-2 pKa k Robusztus Robusztus !!! K’ !!! pH=8 Nem robusztus !!! pH=2 pH A pH szerepe az RP-HPLC-ben

15. Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben Pufferekkel szemben támasztott követelmények: • A puffer UV cut-off-ja kisebb mint a detektálási hullámhossz; • Szilárd szennyező mentes (szűrni kell !!!); • Adott pH-án mikroorganizmusok (alga, baktérium) képződése; • Puffer kompatibilitás a szerves oldószerekkel (kicsapódik magas szerves oldószertartalomnál-szerves pufferek oldékonysága nagyobb); • A minta stabilitása nagy legyen az adott pufferben; • Puffer mentesítés (vízzel kezdjük majd szerves oldószerrel);

16. Ismétlés vége

17. Izokratikus ill. gradiens elúció IZOKRATIKUS mAU tR (min) GRADIENS mAU tR (min)

18. Izokratikus ill. gradiens elúció F C 30% ACN 70% 20mM Foszfát, pH=6.95 D B A E F A D C F E B 50% ACN 50% 20mM Foszfát, pH=6.95 A A: Feniletilamin B: Piridin C: 2-Picolin D: 2,4 Lutidin E: 4-ethylpiridin F: 2,3 dimetilanilin F D+E B+C 80% ACN 20% 20mM Foszfát, pH=6.95 A Az eluens erősség változása

19. Gradiens elúció

20. Gradiens elúció Pumpa, injektor, mixer, kapillárisok….

21. Gradiens elúció Gradiens elúció problémák:Egyensúly beállás idő;Mozgófázis tisztasága („0” –lépésként oldószer ellenőrzése);Retenciós sorrend (szelektivitás) változása;Oldószer probléma (k>10 vs. a minta oldása); Detektor kompatibilitás (pl. RI detektor).

22. Gradiens elúció – nyomás profil Viszkozitás – összetétel összefüggés Kísérleti körülmények: Purosphere C18, 5mm; 125*3mm, 25C 0,56ml/perc 1 ml/perc 75% AcN 100% AcN 0,56ml/perc

23. HPLC pumpák fajtái Syringe Pumps Discontinuous Pumps Gas driven displacement pump Membrane Pumps Continuous Pumps Piston Pumps

24. Pumpa Áramlás <20µL/min (általában 1 - 2 µL/min) MS detektor • Előnye: • Pulzálás mentes; • Egyszerű szerkezet; • Hátránya: • Újrafeltöltést igényel; Fecskendő pumpa Fecskendő típus (Syringe pumpa);

25. Pumpa Pneumatikus erősítésű (Haskel –típus); levegő levegő eluens eluens szelep szelep

26. Diaphragm Pumps

27. Pumpa Alternáló mozgást végző, dugattyús pumpák.

28. Dual Piston Parallel Pump Check Valves Rotary Switching Valve Pumphead Piston A B Combined Single Piston Delivery Delivery Piston 'A' Advancing Piston B Retracting

29. Dual Piston Pump in Series

30. Ballvalves for Reciprocating Piston Pumps

31. Pumpa Alternáló mozgást végző, dugattyús pumpák. • Előnye: • Folyamatos, megbízható működés; • Egyszerű szerkezet; • Hátránya: • Pulzálás; Csoportosítás: Alacsony nyomású; Magas nyomású keverést megvalósító pumpa. Oldószer kompresszibilitás kérdése!!! Pulzálás csillapítóflexibilis membrán és Kompresszálható folyadék

32. Gradient Formation Low Pressure Gradient High Pressure Gradient

33. Eluensszállítórendszer

34. Pump summary The pump is the most critical piece of equipment for a successfully operating HPLC. Performance Parameters for HPLC pumps: • Flow Precision • Flow Range • Delay Volume • Pressure Pulse • Composition Precision

35. MIP-MolecularlyImprinted Polimer Célvegyület Polimerizáció (UV vagy T) Célvegyület Monomerek Extrakció Célvegyület - célvegyület MIP Elrendeződés

36. MIP-MolecularlyImprinted Polimer MIP-alkalmazás

37. Affinitás kromatográfia

38. Affinitás kromatográfia • Alkalmazások: • Immunaffinitás kromatográfiával az oszlopon megkötött antitestekkel (antibodies) antigéneket tisztítunk; • Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálására; • Ellenanyaggal tisztíthatjuk azt a vegyületet, amely az ellenanyagot termelte; • Immobilizált antitestekkel toxinokat kötnek meg vérből (hemoperfúzió); • Szilárd fázisú immunoassay alkalmazásokban. • Az ipar biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek ipari méretekben történő gyártására.

39. + + + + + + + + Affinitás kromatográfia • Állófázis (mátrix)90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer. ligandum távtartó

40. NH-IgG Gél NH-IgG Immunoadszorbens Affinitás kromatográfia CO-CH2 + IgG-NH2 Gél OCH2CONH(CH2)2NHCO(CH2)2COO-N CO-CH2 távtartó Kapcsolások hatékonysága 60-75%; Oszlop kapacitása 8-12 mg IgG/ml gél.

41. Affinitás kromatográfia • 1. Kondicionálás • Puffer

42. Affinitás kromatográfia 2. Mintafelvitel és mosás • Puffer

43. Affinitás kromatográfia 2. Eluálás • Eluáló szer

44. Affinitás kromatográfia egyensúly egyensúly Minta megkötődése, egyéb komponensek eluálása Minta eluálása Abszorbancia mAU váltás elúciós pufferre mintafelvitel 1-2 ot. x ot. 1-2 ot. >1 ot. 1-2 ot. Oszlop térfogat (ot)

45. Affinitás kromatográfia Immobilizált fém affinitás kromatográfia (immobilized metal affinity chromatography - IMAC) • Immobilizáljuk a fémet kelát képző ligandumok segítségével; • Különböző stabilitású komplexek képződnek a fém és olyan proteinek között, amelyek elektron donor csoportot tartalmaznak (pl hisztidin, triptofán, cisztein vagy foszfát csoport). • A komplex stabilitása függ a ligandum, fém típusától, elektron donor csoport sztérikus hozzáférhetőségétől, hőmérséklettől, pH és kompetitív donor jelenlététől. Alkalmazott pH=6-8. • Eluálás pH gradienssel vagy a glicin, hisztidin, hisztamin, cisztein koncentrációjának növelésével (N és/vagy S tartalmú vegyületek, amelyek erős elektron donorként leszorítják a proteint a fémről).

46. Gélkromatográfia A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI MODELLJE

47. Gélkromatográfia • 102-108 Dalton méretű molekulák méret szerinti elválasztása • Alkalmazások: • Polimerek, polimer adalékok vizsgálata; • Biopolimerek, peptidek, enzimek elválasztása; • Molekulatömeg eloszlás, átlag molekulatömeg meghatározás; • Minták tisztítása (peszticidek meghatározása élelmiszer mátrixból); • A minta sómentesítése; • Puffer csere.

48. Gélkromatográfia Gél szemcse Pórusok (dp> 100A) Állófázis a kolonnában Nincs kölcsönhatás a minta-molekula és az állófázis között!! Eltérő méretű molekulákból álló minta

49. Gélkromatográfia „Fordított szita” Abs 265nm Idő (perc) Eltérő méretű molekulákból álló minta

50. Teljes kizárási tartomány lgM Mérési tartomány Teljes áteresztési tartomány V (ml) Gélkromatográfia • Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat); • Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás; • Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans);