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Testes de sensibilidade: difus o por disco e E-test

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Testes de sensibilidade: difus o por disco e E-test

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Presentation Transcript

    1. Testes de sensibilidade: difusão por disco e E-test Daniel Archimedes da Matta Laboratório Especial de Micologia-DIPA UNIFESP – EPM lemits@terra.com.br

    4. Desenvolvimento de testes de susceptibilidade a antifúngicos Aumento da necessidade de testes de susceptibilidade: inúmeros relatos de resistência a antifúngicos novas drogas disponíveis CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute (antigo NCCLS): estudos multicêntricos para padronizar testes de susceptibilidade a antifúngicos com leveduras e fungos filamentosos (“guidelines” para diluição em caldo)

    6. Variáveis relevantes na padronização do ensaio Solubilização de drogas Tamanho do inóculo Meio de composição definida e tampão Temperatura do ensaio Tempo e critérios de leitura Avaliação da correlação clínica Estabelecimento de “breakpoints”

    7. Metodologia NCCLS: diluição em caldo Meio: Inóculo: Temperatura: Tempo de leitura: Critério de leitura: RPMI-1640 tamponado c/MOPS 0,5 a 2,5 x 103 cels/mL 35ºC 48 horas Anfo: inibição total Azóis: inibição significativa (trailing)

    8. Correlação in vitro versus in vivo CIM não é variável física ou quimicamente mensurável, sofrendo influências biológicas diversas Fatores relacionados ao hospedeiro são geralmente mais importantes que testes de susceptibilidade para definir resposta terapêutica Susceptibilidade in vitro pode não implicar em sucesso terapêutico Resistência in vitro geralmente associa-se a falha terapêutica

    9. A regra do “90-60” Infecções por microrganismos susceptíveis repondem à terapêutica apropriada 90% das vezes Infecções por microrganismos resistentes respondem à terapêutica 60% das vezes

    18. Descrição da Metodologia Placa de petri 90mm para testar um único antifúngico Placa 120mm para ate 3 antifúngicos Fita plástica contendo os antifúngicos RPMI 1640 + 1.5% de agar suplementado com 2% de glicose Microrganismo puro com subcultivo recente (18-24h) 0.5 de McFarland (espectrofotômetro) Swab Temperatura de incubação: 35°C Tempo de incubação: 24h (azólicos e 5FC) e 48h (anfotericina B) Critério de leitura: inibição parcial (azólicos e 5FC) e total (anfotericina B)

    24. Resistência a anfotericina B em isolados de Candida lusitaniae por ETEST Candida lusitaniae possui Resistência intrínsica a anfotericina B 47 isolados 9 isolados eram reconhecidamente resistentes Macrodiluição NCCLS em RPMI e AM3 (Antibiotic Medium 3) ETEST em RPMI e AM3 com leitura de 24h e 48h > 0.38 mg/ml Resistência (critério sugerido por Clancy e Nguyen, 1999)

    25. Resistência a anfotericina B em isolados de Candida lusitaniae por ETEST

    26. Resistência a anfotericina B em isolados de Candida lusitaniae por ETEST

    27. Correlação entre Etest e microdiluição para isolados de Candida spp. Colombo et al. (1995) Martin-Mazuelos et al. (1999) Chryssanthou (2001) Barry et al. (2002) Morace et al. (2002) Matar et al. (2003) Pfaller et al. (2004)

    28. Disco difusão Documento M44-A (aprovado) – NCCLS 2004

    32. Cuidado na distribuição do inóculo

    33. Isolado Sensível , com halo de inibição bem definido

    36. Concordância de resultados entre sistemas comerciais de avaliação de susceptibilidade ao fluconazol e o NCCLS c/ 48 horas de incubação

    38. Correlação entre Disco difusão e microdiluição para isolados de Candida spp. frente ao fluconazol Barry et al. (2002) Morace et al. (2002) Matar et al. (2003) Pfaller et al. (2004)

    39. Inoculado com swab com uma suspensão de células ajustado pelo turbidimetro em escala 0,5 Mc Farland Placas incubadas a 35oC e leitura de 18 a 24 h Todos os isolados foram preservados em ágar , sendo enviados para o laboratório central em Iowa para realização de identificação , teste de susceptibilidade e posterior congelamento. Foram selecionados isolados de Candida spp com significância clínica nos sítios de infecção (sangue e sítios esterilizados) que causam doença invasiva através de trabalhos em hospitais sentinela da América do Norte, América Latina, Europa, África e Ásia . Monitoramento do diâmetro do halo do disco para fluconazol reportado em 54 diferentes centros médicos entre 2001 e 2002.

    40. Resultados do halo de inibição dos centros participantes X NCCLS dos Laboratório Referência

    41. Resultados do halo de inibição X NCCLS – ambos realizados no laboratório referência

    42. “É importante ter em mente que os critérios para teste de susceptibilidade a antimicrobianos são resultado da colaboracão de várias ciências, fé e trabalho…”

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