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Analytische Charakterisierung der traditionellen chinesischen Medizin (TCM). Seminar 2 30.05.2012 Benjamin Hanf. Geschichte. -13 Jhd. v. Chr. -8 bis -1 Jhd. v. Chr. heute.
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AnalytischeCharakterisierungdertraditionellenchinesischenMedizin (TCM) Seminar 2 30.05.2012 Benjamin Hanf
Geschichte -13 Jhd. v. Chr. -8 bis -1 Jhd. v. Chr. heute Geister / Magie Entsprechungsmedizin Reaktion des Ernährung mit Kraut namens ImmunsystemsKu-Jung Verhütungsschutz Verbreitung
TCM ist: • Physiotherapie • Akupunktur / Moxibustion (Akupunktur mit Erwärmung der Punkte) • Massagetechniken (TuinaAmno, Shiatsu) • Bewegungsübungen (Quigong, Taijiquan) • Arzneimitteltherapie Arzneitherapie: Wie in der Medizin, die wir kennen Weitere Bestimmung: - Kombinierbarkeit und Unverträglichkeit mit anderen Drogen - Toxizität und die Dosierung entsprechend der Verabreichungsform
Meinungen über TCM • Wieso ist das Misstrauen gegen TCM so hoch? • Akupunktur-Studie: • Korrekten Einstich-Punkte vorsätzlich missachtet, dennoch selben „heilenden“ Effekte berichtet • Vergiftungsfälle (Aristolochiasäuren; die genotoxisch, kanzerogen, nierenschädigend) • In hohen Konzentrationen in manchen Pflanzenwurzeln vorhanden (bis 10%) • positiver Effekt: Schlankheitsmittel, regen laut TCM Blutfluss an • Gemisch aus vielen verschiedenen Wirk- und Hilfsstoffen • Tierprodukte + Pflanzen, Rezepte online verfügbar (tcmassistant.com) http://www.pharmazeutische-zeitung.de/index.php?id=pharm1_37_2004
Arten- und Tierschutz Gefährdete Tierarten (in TCM verwendet) Tiger Zerstörung des Lebensraums Schneeleopard Asiatischer Schwarzbär Bärenfarmen Nashorn Chin. Viagra: Nashorn-Hornmehl Saiga-Antilope (1990 vom WWF: Substitut für Nashorn) Sägerochen Seepferdchen Schildkröten gering gefährdet vom Aussterbe bedroht
Mixturen mit tausend möglichen Wirkstoffen http://de.wikipedia.org/wiki/Traditionelle_chinesische_Medizin
Screening für unbekannte Wirkstoffe mit Hilfe von HSA (human serum albumin) LongdanXieganDecoction (LXD) Gelbsucht, Blasen- und weitere Entzündungen Chromatogramm mit HSA-Säule (RP-HPLC); Yun Wang et al., 2007: Biological fingerprinting analysis of the traditional Chinese prescription LXD Wechselwirkung mit menschlichem Blut HPLC
Screening LXD 2D Chromatographie ODS Octadeca-(C18-) Säule ACN Acetonitril ODS, Gradient: 1% ACN – 60% ACN in 5Min 5 Min ODS, Gradient: 1% ACN – 90% ACN in 65Min 50 Min Trennung einzelner Peaks (RP-HPLC); Yun Wang et al., 2007: Biological fingerprinting analysis of the traditional Chinese prescription LXD
Screening LXD 2D Chromatographie mV t in Min. 2D-Analyse; Yun Wang et al., 2007: Biological fingerprinting analysis of the traditional Chinese prescription LXD Analyse der einzelnen Fraktionen Separation von 100 Komponenten (19) Einzelne Ergebnisse
Detektion mittels MS Detektion von Tanshinonen in „Dan-Shen“ Wirkt gegen hämatologische Abnormalitäten und Cardiovascular-Erkrankungen Detektion: ESI-MS • Ziel: • Medikamentenentwicklung • Qualitätskontrolle MS
Detektion MS Ergebnistabelle Min Yang et al., 2006 „Characterization of tanshinones in the roots of Salvia miltiorrhiza (Dan-shen) by high-performance liquid chromatography with electrospray ionization tandem massspectrometry“
Detektion MS Ergebnistabelle • 35 Tanshinone • 27 charakterisiert • 9 eindeutig nachgewiesen werden (Referenzstandards; Retentionszeiten) • Strukturen unbekannter Peaks konnten anhand der MS aufgezeigt werden • 5 neue Verbindungen
Detektion MS Beispiel Min Yang et al., 2006 „Characterization of […]“
Detektion MS Beispiel Min Yang et al., 2006 „Characterization of […]“ Bsp. unbekannte Substanz
Extraktion • Wie kann man die aktiven Komponenten aus den TCM-Mixturen gewinnen • SFE: Supercritical Fluid Extraction • PLE: Pressurised Liquid Extraction • MAE: Microwave-assisted Extraction • UAE: Ultrasonic-assisted Extraction • MISPE: molecularly imprinted polymer solid phase extraction
UAE Ultrasonic-assisted Extraction Vgl. : Ultraschallbad, Kavitationseffekt Abbildungen Masters Thesis Lindau; Lindau, Olgert „Dynamik und Lumineszenz lasererzeugter Kavitationsblasen (1998) DPI Schallwellen: Druckabfall Blasenbildung in LM Druckanstieg Blasen implodieren resultierende Flüssigkeitsstrahlen auf Feststoff Scherkräfte • niedrige Temperaturen • gesteigerter Massentransfer durch mechanische Effekte Bsp.: Rutin aus Euonymus alatus (TCM: Antimikrobiell, Blutdrucksenkend)
Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin: • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber MISPE molecularly imprinted polymer solid phase extraction
Extraktion Beispiel: • Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin : • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber N2-Begasung, 60°C Acrylamid Template THF EGDMA und AIBN Stoffe
Extraktion Beispiel: • Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin : • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber Rutin Strukturformel Acrylamid Template THF EGDMA und AIBN
Funktionsweise MIPs Probe + MIPs Waschschritt Elution des Analyten Modifiziert nach Lin Peng et al., 2010 „Schematisches Diagramm der MIPSE Prozedur“
Nachweis via HPLC Chromatogramm Standards Lösung vor MISPE Lösung MIPs nach Wachschritt Elution des Analyten Modifiziert nach Lin Peng et al., 2010 „Schematisches Diagramm der MIPSE Prozedur“
Test mit verschiedenen anderen TCMs Modifiziert nach Lin Peng et al., 2010 „Chromatogramme behandelter TCM-Proben“
Test mit verschiedenen anderen TCMs Ausbeute Ausbeute in %: 93,43 90,11 92,31 90,01 Modifiziert nach Lin Peng et al., 2010 „Tabelle über Effizienz der MIPSE Prozedur“
Nachweis der Wirksamkeit Modifiziert nach Li Liu et al., 2011 „Effekte auf Viskosität bei versch. Scherraten“ • - Asp gleich mit HSYA, Amy bei hohen Scherraten • - Bei niedrigen Scherraten Asp gleich mit TH oder Amy + HSYA • Wirkende Hauptkomponenten in TH: Amy + HSYA (aktiviert Blutfluss, löst • Blutstauung auf) Amy + HSYA
Zusammenfassung TCM: - TCM und deren Wirkung - Nashorn-Hornmehl, Akkupunktur - Bärengalle (synthetisch Herstellbar), TH - Extraktionsmethoden sehr vielfältig - Optimierung: MIPs, HSA + Chromatographie - Detektion (MS, HPLC) - Identifizierung nicht immer eindeutig und komplett - Aktivität / Funktion testen (TH) - Optimierung: Entwicklung biologischer Modelle Potentiell interessante Wirkstoffe aus TCM in westliche Medizin integrieren
Bärenfarm http://www.geo.de/GEO/natur/tierwelt/3613.html?p=2 China, Korea, >14.000 Tiere Überangebot Kosmetika und anderen Luxusprodukten Chin. Medikamentenbeschreibung
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Bärenfarm • „beseitigt Hitze in der Leber“ • „schafft Erleichterung bei Krämpfen und krampfartigen Anfällen“ • „verbessert die Sehschärfe“ • „entfernt Hitze und giftige Stoffe“ Auflösung von kleinen Gallensteinen und zur Behandlung einer Reihe von Lebererkrankungen zurück
Wirkt TCM wirklich? Vorteil dieser Studie: Einfache Komposition aus nur zwei verschiedenen Einheiten in der TCM (normalerweise deutlich mehr) Taoren–Honghua (TH) soll Blutzirkulation anregen Wirkende Substanz (Hauptkomponenten in TH): Amygdalin (ca. 1,696% in TH) und Hydroxysafflor yellow A (HSYA, ca. 0,909% in TH) Amygdalin spaltet in Gegenwart von Wasser Blausäure ab Vergleich zu Aspirin als Blutverdünnungsmittel; „Aspirin-Resistenz“
Arbeitsweise: • - Kräuter ernten (identifizieren, Reinheitsgrad bestimmen, dieser liegt hier bei 95-98%) • - Extraktion (Aufschluss, Lösen der Substanzen, Filtration) • - Mischen der beiden Extrakte, Aufkonzentrierung (vacuum concentration) • Trennen der Komponenten via RP-HPLC (stat. Phase: GRACE-Apollo-C18 (150*4,6 mm) mit Gradient von 15% -38% MeOH (30 Min)-54%(60 Min) • UV-Detektor: 210, 310, 405 nm (Abs. 200 nm-410 nm) • Substanz dem Testorganismus verabreichen • Blutfluss zum Stillstand bringen (Adrenalin injizieren + Testorganismus in eiskaltes Wasser aussetzen, alle außer Kontroll-Gruppe) • Blut untersuchen (Viskosität: WBV)
Nachweis der Hauptsubstanzen Standard Probe mit TH
- Asp gleich mit HSYA, Amy bei hohen Scherraten • - Bei niedrigen Scherraten Asp gleich mit TH oder Amy + HSYA • Wirkende Hauptkomponenten in TH: Amy + HSYA (aktiviert Blutfluss, löst • Blutstauung auf) zurück
hohes Lösemittelvermögen SFE Supercritical Fluid Extraction niedrige Viskosität Abbildung: Modifiziert nach SupercriticalCO2 (Quelle: Sticher, (2008)) • - Kurze Extraktionszeiten • Umweltschonend (CO2: Tk 31°C, pk 73,8 bar) • geringe Kosten, milde Bedingungen (T>Tk, p>pk) Bsp.: Koffein aus Kaffepulver zurück
PLE Pressurised Liquid Extraction Erhöhter Druck: 10-15 mPA, erhöhte Temperatur: 50°C - 200°C Abbildung: Komponenten PLE-Systems (Quelle: Sticher, (2008)) • Sehr kurze Extraktionszeiten • selektiv durch Einstellen der Temperatur, LM • sehr Effizient Bsp.: Anthocyane aus roten Trauben (bei koronaren Herzerkrankungen) zurück
MAE Microwave-assisted Extraction Erhöhter Druck: 300 kPA, >250 W, polares Lösemittel Abbildungen: Komponenten PMAE und FMAE Systems (Quelle: Sticher, (2008)) • Sehr kurze Extraktionszeiten • selektiv durch Einstellen von: W, LM • sehr Effizient Bsp.: Flavonoide aus Ge Gen (TCM: Kopfschmerzen, Bluthochdruck) zurück
Extraktion Beispiel: • Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin : • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber Template THF
Extraktion Beispiel: • Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin : • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber Acrylamid Template THF
Extraktion Beispiel: • Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin : • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber EGDMA (ethyleneglycoldimethacrylate) und AIBN Acrylamid Template THF zurück
Screening LXD Online-Analyse mittels MS Identifizierung von 19 Komponenten anhand Retentionszeit, UV Spektrum, Molekulargewicht, MS Links UV Spektrum, rechts MS Spektrum Yun Wang et al., 2007: Biological fingerprinting analysis of the traditional Chinese prescription LXD Komponenten müssen auf Wirkung getestet werden (einzige Komponente / mehrere gleichzeitig wirksam?) zurück
Detektion MS Beispiel unbekannte Substanz m/z 275 ([M+H–18]þ), 247([M+H–18–28]þ), 219 ([M+H–18–56]þ) 204 ([M+H–18–56–15]þ) Min Yang et al., 2006 „Characterization of […]“ MS
Detektion MS Beispiel unbekannte Substanz m/z 275 ([M+H–18]þ), 247([M+H–18–28]þ), 219 ([M+H–18–56]þ) 204 ([M+H–18–56–15]þ) Ähnlich zu Tanshinone IIA Min Yang et al., 2006 „Characterization of […]“
Detektion MS Beispiel unbekannte Substanz Tanshinone IIA Didehydrotanshinones IIA DB 15-16 DB 15-16 DB 2- 3 Rt 28,16 Rt 28,6 um 2 Th Unterschied zu Tanshinone IIA Didehydrotanshinones IIA Min Yang et al., 2006 „Characterization of […]“ zurück