POLIAKRILAMIT JEL ELEKTROFOREZI: PAGE

2. Proteinler izoelektrik noktalarinin �zerindeki pH degerlerinde (?) y�kl�d�rler ve elektriksel alanda anoda g�� ederler;izoelektrik noktanin altindaki pH degerlerinde ise (+) y�kl�d�rler ve katoda g�� ederler.

3. Bu �zellikleri nedeniyle protein karisimlarinin ayrilmasinda elektroforez y�nteminden genis �apta yararlanilir. Bu teknik proteinlerin elektriki alanda g���ne dayanir.

5. KULLANILAN JELLER: NISASTA AGAROZ SEL�LOZ ASETAT POLIAKRILAMIT (EN GENIS �APTA)

8. KATALIZ�R: TEMED (N,N,N',N' -TETRAMETILENETILENDIAMIN

10. Poliakrilamit jelde por b�y�kl�g�, akrilamit ve bis i�erigini ifade eden % T ve % Cbis terimleri ile belirlenir.% T, total akrilamit % si (agirlik/hacim);% Cbis ise bis�in monomere orani (agirlik/agirlik) olup form�llere g�re hesaplanirlar:

11. Akrilamid (g) + Bis (g)% T = ----------------------------------------- x 100 Hacim (ml) Bis (g)% Cbis= ------------------------------- x 100Akrilamid (g) + Bis (g)

12. Bu form�llere g�re: %20 T ve %5 Cbis i�eren bir jelde %20 total akrilamit (akrilamit + bis) bulunur ve total akrilamitin % 5�i bis�tir. %T arttik�a por �api k���l�r. %5 Cbis her t�rl� % T kosulunda optimum por b�y�kl�g�n�n olusmasina yol a�ar.

13. �esitli akrilamit konsantrasyonlarinda ayrimi yapilabilecek polipeptit agirliklari Akrilamit konsantrasyonu pp.agirligi(kDa) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5 57-212

17. G�� KAYNAGI

18. Kullanilan prosed�re g�re hazirlanan monomer karisimi, elektroforez aletinin jel d�kme aparatinda, jelin �esitli kalinlik ve ebatta hazirlanabilmesine olanak veren, sandvi� seklinde hazirlanmis iki cam (jel kaseti) arasina veya jel t�plerine doldurulur, tarak takilir ve polimerizasyona birakilir.

19. Oksijen polimerizasyonu engellediginden, monomer karisiminin havasi alinmalidir. Bu da karisimdan inert bir gaz ge�irerek, vakum uygulayarak ya da ultrasonik su banyosunda bekletilerek saglanir.

20. Jel karisimi t�p ya da kaset i�ine d�k�ld�g�nde, �st y�zeydeki gerilim nedeniyle ortaya �ikan egimli y�zey, bant dagiliminin bozuk olmasina yol a�ar. Bunu �nlemek i�in, polimerizasyon baslamadan �nce jelin y�zeyi �ok ince bir su veya su ile doyurulmus 2-butanol tabakasi ile kapatilir.

21. Aletin tank b�l�m�ne yerlestirilir.Bu yerlestirimden sonra jel tamponla temas edecek ve elektrik akiminin ge�mesi saglanacaktir.

23. Elektroforezde kesiksiz (�continuous�) ve kesikli (�discontinuous�) olmak �zere 2 farkli tampon sistemi kullanilabilir. Kesiksiz sistemde tek bir ayirici jel vardir; tanklarda ve jelde ayni tampon kullanilir. Kesikli sistemde ise jel farkli tamponlarla hazirlanmis iki kisimdan olusur: (1) B�y�k porlu y�kleme (�stacking�) jeli; (2) K���k porlu ayirma (�separating�) jeli.

25. Bu sistemde kullanilan tank tamponlari da jel tamponlarindan farklidir. Bu farklilik jel boyunca bir pH ve voltaj gradientinin olusumuna yol a�ar. B�ylece daha seyreltik �rneklerle �alisilabilir ve daha iyi bir ayrisim elde edilir.

26. Elektrik akimi ge�irmek �zere anot ve katot baglantilari yapilir ve g�� kaynagi �alistirilir: Protein elektroforezinde elektriksel parametrelerden biri, genellikle akim sabit tutulur. Bu durumda proteinlerin g�� hizi da sabittir, ancak diren� artik�a isi a�iga �ikar. Islem sabit voltajda ger�eklestirilirse, diren� artik�a g�� hizi d�ser, ancak isi artmaz.

27. ISLEM TAMAMLANIGINDA: boyama yapilarak ayrilan proteinler g�zle g�r�n�r hale getirilir. En �ok kullanilan boyar madde �Coomassie blue� dur. Daha duyarli bir boyama teknigi ise g�m�s boyamadir. Jel boyandiktan sonra fotografi �ekilebilir, ya da densitometre ile taranarak analiz edilebilir. Jelde ayrilmis radyoaktif �rneklerin analizi i�in otoradyografi y�ntemlerinden yararlanilir. Membrana transfer (�blot-transfer�) teknikleri de son yillarda genis �apta kullanim alani bulmaktadir. (Western blotting ve imm�noblotting)

28. PROTEIN ELEKTROFOREZINDE ALTERNATIF SAPTAMA Y�NTEMLERI

29. G�M�S BOYAMA

30. Duyarlilik y�ksek oldugu i�in TEMIZLIK �ok �nemlidir. Cam esyalar �ok temiz olmali, T�m ��zeltiler filtre edilmeli, Daima eldiven giyilmeli (fakat �zerinde pudra kalmamali), Eger m�mk�nse her adim i�in ayri bir kap kullanilmalidir.

31. Kullanimdan sonra Ag ��zeltileri LAVABOYA D�K�LMEMELIDIR! Seyreltik (0.1 N) HCl ��zeltisine d�k�lerek zararsiz AgCl sekline �evrilmelidir. B�ylece potansiyel patlayici Ag komplekslerinin olusmasi �nlenmelidir.

32. Ag boyama

33. SONU�LARIN KAYIT ALTINA ALINMASI: �zellikle g�m�s boyamada en iyi bant g�r�nt�s�n�n ne zaman olusacagi belirsizdir. Onun i�in boyamanin son asamalarinda 3-4 dakika araliklarla birka� kez fotograf �ekilir.

34. Coomassie blue

35. JELLERIN KURUTULMASI Jel, kurutularak da saklanabilir. Otoradyografi yapilacaksa mutlaka kurutulmalidir. Ancak bu islem oda sicakliginda filtre kagidi �zerinde bekletme seklinde yapilamaz, ��nk� jel b�z�l�r ve kirilir. Bu ama�la gelistirilmis aletler vardir. Ancak sistem basit oldugu i�in pratik olarak gelistirmek de m�mk�nd�r.

38. JEL G�R�NT�LEME SISTEMI

41. SDS-PAGE: SODYUM DODESILS�LFAT-POLIAKRILAMIT JEL ELEKTROFOREZI SDS, polipeptidlerin ana iskeletini �evreleyerek proteinleri denat�re eden anyonik bir deterjandir. Ayrica proteine, yapinin uzunluguna bagli olarak degisen oranda bir negatif y�k kazandirmaktadir. Polipeptidler SDS ve indirgeyici bir ajanla isleme sokuldugunda, ayni y�k yogunluguna sahip, fakat farkli uzunlukta (?) y�kl� yapilar haline d�n�s�rler.

42. SDS-PAGE : Polipeptidlerin molek�l agirliklarinin belirlenmesine olanak verir. Proteinleri denat�re ettigi i�in (alt birimler ayrildigi i�in) proteinin monomerik mi, oligomerik mi oldugunu anlamamiza yardim eder. Ancak biyolojik aktivite ortadan kalkar.

43. Determination of molecular weight of proteins by SDS-PAGE Proteins, those molecular weights are unknown (samples) and those molecular weights are known (STANDARDS) are electrophoretically separated on the same gel and stained.