Chap III Régulation de l’expression des gènes

1. Chap III Régulation de l’expression des gènes

2. L’opéron lactose La bactérie E. coli utilise le lactose comme source de carbone… Densité Optique Source de carbone = glucose Source de carbone = lactose temps …mais moins efficacement que la glucose

3. Métabolisme du glucose et lactose Lactose Glucose Perméase au lactose perméase glucose Membrane bactérienne Glucose + Galactose Glucose Lactose β-galactosidase Glycolyse Energie + Carbone Croissance • L’utilisation du lactose implique les mêmes enzymes que celles nécessaires pour le glucose mais aussi une perméase et la β-galactosidase

4. Réplique sur velours Analyse génétique du métabolisme du lactose • Recherche de mutants incapables d’utiliser le lactose : phénotype [lac-] Mutagenèse UV Glucose Incubation à 37°C [lac-] Lactose Glucose

5. lac+ F’ lac+ lacZ- Test de dominance • Le mérodiploïde (F’(lac+)/lacZ- ) a le phénotype [lac+] • La mutation lacZ- est récessive

6. lacY- F’ lac+ LacZ- Tests de complémentation • Le mérodiploïde a le phénotype [lac+] • Les mutations lacZ- et lacY- affectent des gènes différents

7. Conclusion analyse génétique : 2 gènes impliqués dans le métabolisme du lactose : lacZ et lacY Les mutations sont récessives : perte de fonction du gène Mutant lacZ- : incapable de métaboliser le lactose quelle que soit la [C]lactose dans le milieu de culture. Des expériences avec du lactose radioactif montrent qu’il est transporté dans la cellule. Pas d’activité β-galactosidase : le gène lacZ code la β-galactosidase Mutant lacY- peut métaboliser le lactose si [C]lactosedans le milieu de culture est forte. L’activité β-galactosidase est alors normale (même paramètres cinétiques que la β-galactosidase sauvage) : le gène lacY code la perméase au lactose. Les analyses de croisements entre les mutants montrent que ces deux gènes sont très proches l’un de l’autre. lac Z lac Y

8. L’induction : En absence de lactose dans le milieu de culture, pas d’activité β-galactosidase détectable : il existe un inducteur • le lactose lui même? • produit de dégradation du lactose? L’IPTG, isopropyl thiogalactoside est un analogue non métabolisable du lactose. Il n’est donc pas clivé par la β-galactosidase ; pourtant c’est un inducteur de l’expression de la β-galactosidase : on parle d’inducteur gratuit

9. Les mutants constitutifs Chez ces mutants, en présence de glucose comme seule source de carbone, la β-galactosidase est produite : perte d’induction ; les souches sont toujours de phénotype [lac+], car toujours capables de dégrader le lactose Mutant lacI- Mutation récessive (pas de β-galactosidase produite dans une souche F’(lacI-)/lacI+) = dans la souche lacI-, la protéine codée par lacI n’est pas fonctionnelle En l’absence de la protéine LacI, les gènes lacZ et lacY sont transcrits quand il y a du glucose comme seule source de carbone. La protéine LacI est donc un répresseur. Ce répresseur ne fonctionne que quand il n’y a pas de lactose lac Z lac Y lac I Effet direct? BASE DU RAISONNEMENT EN GENETIQUE

10. Les mutants constitutifs 2 : Le mutant Oc Le mutant Oc a un phénotype constitutif L’allèle Oc présente une relation de dominance/récessivité originale vis à vis de l’allèle sauvage pour le phénotype constitutif ! Activité β-galactosidase Génotype Phénotype Dominance [lac+] lacOCdominant/lacO+ Constitutive F’(lacOc,lacZ+)/lacO+,lacZ- lacO+dominant/lacOC [lac+] Inductible F’(lacOc,lacZ-)/lacO+,lacZ+ • ???????????????

11. lac Z+ lac I OC lac Z- O+ lac I lac I O+ lac Z+ Activité β-Galactosidase Mutant : constitutive Mérodiploïde 1 : lac Z+ OC lac I constitutive Mérodiploïde 2 : lac I OC lac Z- inductible • Chaque fois que Oc et lacZ+ sont sur le même brin d’ADN (en cis), • Le phénotype est constitutif; idem avec lacY+ • La mutation Ocest cis-dominante

12. L’opérateur lacO O+ lac Z lac I lacY Transcription Traduction • La région lacO est le site de fixation du répresseur. Dans le mutant lacOc, le répresseur LacI est incapable de se fixer sur l’opérateur, d’où l’absence de répression et le phénotype constitutif. lacO est donc une séquence d’ADN reconnue par une protéine

13. Mutants non inductibles 1: la région P (promoteur) • Ces mutants ont un phénotype [lac-] : • La mutation lacP- est cis-dominante : lacP est le promoteur, site de fixation de l’ARN polymérase (sous unité σ) O+ P lac Z lac I lacY σ

14. lac Z+ O+ lac I+ Activité β-Galactosidase Mutants non inductibles 2: Le mutant lacIs La mutation lacIs est dominante : en présence de lactose( ) lac Z- P O+ lacIs Non inductible [lac-] P Non actif en présence de lactose lactose L’allèle lacIs est un répresseur « super actif ». Contrairement à la protéine LacI, LacIs est incapable de fixer le lactose

15. Un premier modèle : l’opéron Un ensemble de gènes régulés par un opérateur En absence de lactose : O+ lac Z lac I lacY lacA P Transcription Traduction En présence de lactose : σ lac Z lacY lacA O+ lac I+ P Non actif en présence de lactose lactose

16. Un seul ARNm, 3 protéines : ARNm polycistronique O+ lac Z lac I lacY lacA P σ perméase acétylase β-galactosidase

17. Croissance dans un milieu contenant du glucose ET de lactose Densité Optique temps Le glucose empêche l’utilisation des autres sucres (même phénomène avec le maltose) : répression catabolique. Le modèle proposé n’explique pas cela… Adaptation métabolique Consommation du glucose Consommation du lactose

18. Recherche de mutants qui « miment » l’effet du glucose • Le mutant pousse sur glucose • il ne pousse pas sur lactose, car « il croit » qu’il existe du glucose dans le milieu de culture • il ne pousse pas sur maltose, car « il croit » qu’il existe du glucose dans le milieu de culture

19. Recherche de mutants qui « miment » l’effet du glucose • 2 groupes de complémentation (2 gènes) • Mutations récessives (perte de fonction des gènes) • mutant cya1- : adénylate cyclase : - en absence d’AMPc, la cellule pense qu’il y a du glucose dans le milieu; pas de transcription de l’opéron lactose • mutant cap1- ou crp1- : catabolic activator protein1 (ou cAMP Receptor Protein 1) - en absence de CRP1, la transcription de l’opéron lactose est abolie dans les conditions où normalement lacZ, lacY et lacA sont transcrits : la protéine CRP est un activateur de la transcription. La protéine CRP1 fixe l’AMPc; la fixation de l’AMPc lui permet de se fixer sur l’ADN à proximité du promoteur

20. Les régions promoteur et opérateur de l’opéron lactose GTGAGTTAGCTCACTCA TGTG-GAA-TTGTGAGCGGATAACAATTTCACA CACTCAATCGAGTGAGT ACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT

21. Interaction de CRP avec le promoteur La protéine CRP agit sous forme dimérique La protéine CRP recrute l’holoenzyme

22. En présence de glucose et lactose σ Lactose Glucose Perméase au lactose perméase glucose Membrane bactérienne cya Glucose + Galactose Glucose Lactose β-galactosidase Glycolyse CRP1 lac Z lacY lacA O+ lac I+ P Transcription de l’opéron lactose très faible

23. En absence de glucose CRP1 CRP1 σ Lactose Perméase au lactose perméase glucose Membrane bactérienne cya Glucose + Galactose Glucose Lactose ATP β-galactosidase AMPc + PP Glycolyse CRP1 lac Z lacY lacA O+ lac I+ P opéron lactose actif

24. L’opéron lactose Régulation négative par un répresseur : en absence de lactose, le répresseur est fixé sur l’opérateur et maintient la transcription dans un état réprimé. En présence de l’inducteur (lactose), le répresseur est inactivé et quitte l’opérateur: c’est l’induction Régulation positive par un activateur : En absence de glucose, [AMPc] est forte. La protéine CRP fixe l’AMPc et devient capable de reconnaître une région proche du promoteur. Elle interagit avec l’ARN pol et facilite sont recrutement en -10 et -35 du promoteur. Le modèle opéron de Jacob et Monod : établi d’après l’opéron lactose Un opéron comprend un certain nombre de gènes régulés par un seul promoteur et éventuellement un opérateur. L’ARNm produit est polycistronique. L’expression des gènes contenus dans l’opéron nécessite l’interaction entre des séquences cis (promoteur et opérateur) et des séquences trans (facteurs de transcription).

25. L’opéron tryptophane Il contrôle l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse de tryptophane Pas de Trp Dans le milieu Trp disponible dans le milieu Concentration en enzyme du métabolisme du trp Enzyme Temps La cellule évite de synthétiser les enzymes responsables de la biosynthèse de trp quand cet acide aminé est disponible dans le milieu

26. Pas de tryptophane dans le milieu aporépresseur Gènes de structure P O trpR trpD trpB trpE trpC trpA trpL σ Biosynthèse du trp Beaucoup de tryptophane dans le milieu corépresseur (tryptophane) répresseur aporépresseur Gènes de structure P O trpR trpD trpB trpE trpC trpA trpL

27. Un peu de tryptophane dans la cellule Mauvaise répression car peu de co-répresseur aporépresseur Gènes de structure P O trpR trpD trpB trpE trpC trpA trpL σ ARNm « atténué » • Inhibition de l’élongation de la transcription : l’atténuation

28. 4 2 1 3 UUUUUUU 3 2 UUUUUUU 4 1 Structure de l’ARNm atténué • Lorsque la boucle 1/2 se forme, la boucle 3/4 peut aussi se former. • La boucle 3/4 a la structure d’un terminateur de transcription. • Lorsque la boucle 2/3 se forme, ni la boucle 1/2, ni la boucle 3/4 ne peuvent se former. • La boucle 2/3 est la moins stable des boucles

29. L’atténuation Le tryptophane disponible pour la traduction est en quantité limitée • L’opéron trp est transcrit Suffisamment de tryptophane disponible pour la traduction • Seul l’ARNm atténué est produit C’est la vitesse de traduction du ribosome qui conditionne l’arrêt de la transcription

30. L’opéron tryptophane un double système de régulation • lors de l’initiation de la transcription : ce système détecte une concentration globale de trp dans la cellule et agit par un répresseur. • lors de l’élongation de la transcription : ce système détecte la quantité de tryptophane disponible pour la traduction en mesurant la vitesse de passage des ribosomes au niveau des codons trp. Ce système fonctionne par un mécanisme d’atténuation qui implique un couplage transcription/traduction. • L’atténuation est impossible chez les eucaryotes.

31. Régulation de l’initiation de la transcription chez les eucaryotes • La RNA polII est incapable de reconnaître les promoteurs; l’initiation de la transcription nécessite des facteurs généraux (TFII’s) présents dans tous les types cellulaires . TATA Région transcrite • La régulation de la transcription est assurée par des séquences cis appelées enhancers (UAS : activation) ou silencers (URS : repression), sur lesquels se fixent des facteurs de transcription spécifiques. La position des enhancers et silencers est relativement indépendante de celle du site l’initiation de la transcription. Enhancer ou silencer Région transcrite

32. Mise en évidence des régions cis : méthode gène rapporteur Activité Région transcrite 100% Gène rapporteur 100% Gène rapporteur 250% Gène rapporteur 10% Gène rapporteur silencer enhancer • La méthode gène rapporteur permet de définir les zones cis et d’établir leur fonction (enhancer/silencer)

33. Les gènes rapporteurs outils en génétique du développement pour visualiser l’expression d’un gène La séquence de régulation de la myogénine a été placée en amont du gène rapporteur lacZ de E.coli chez la souris. Des embryons agés de 11 jours ont été sacrifiés et incubés en présence de X-gal Toutes les cellules contiennent le gène rapporteur, mais seules un petit nombre l’expriment