1 / 52

Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium

Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium. Elválasztástechnika. kv1n1lv1. Tételek. A kromatogram és kromatográfiás csúcs főbb jellemzői, tányérelmélet A gázkromatográfiás rendszer felépítése, a gázkromatográfia állófázisai Mintabevitel a gázkromatográfiában

maddox
Download Presentation

Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1

  2. Tételek A kromatogram és kromatográfiás csúcs főbb jellemzői, tányérelmélet A gázkromatográfiás rendszer felépítése, a gázkromatográfia állófázisai Mintabevitel a gázkromatográfiában A gázkromatográfia mozgófázisai, sebességi elmélet Gázkromatográfiás detektorok (kivéve MS) Tömegspektrometriás detektálás a gázkromatográfiában Minta-előkészítés Elektromigrációs módszerek A HPLC-s rendszer felépítése, az egyes elemek szerepe és működése A folyadékkromatográfiás állófázisok fajtái, jellemzése A folyadékkromatográfiás mozgó fázisok és a gradiens elúció Normál fázisú folyadékkromatográfia Fordított fázisú folyadékkromatográfia MIP, affinitáskromatográfia és gélkromatográfia, HIC, HILIC Ionos összetevők elválasztására alkalmas folyadékkromatográfiás módszerek Folyadékkromatográfiás detektorok (kivéve MS) Tömegspektrometriás detektálás a folyadékkromatográfiában

  3. Izokratikus ill. gradiens elúció IZOKRATIKUS mAU tR (min) GRADIENS mAU tR (min)

  4. Gradiens elúció

  5. Pump summary The pump is the most critical piece of equipment for a successfully operating HPLC. Performance Parameters for HPLC pumps: • Flow Precision • Flow Range • Delay Volume • Pressure Pulse • Composition Precision

  6. MIP-MolecularlyImprinted Polimer Célvegyület Polimerizáció (UV vagy T) Célvegyület Monomerek Extrakció Célvegyület - célvegyület MIP Elrendeződés

  7. + + + + + + + + Affinitás kromatográfia • Állófázis (mátrix)90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer. ligandum távtartó

  8. Gélkromatográfia Gél szemcse Pórusok (dp> 100A) Állófázis a kolonnában Nincs kölcsönhatás a minta-molekula és az állófázis között!! Eltérő méretű molekulákból álló minta

  9. Teljes kizárási tartomány lgM Mérési tartomány Teljes áteresztési tartomány V (ml) Gélkromatográfia • Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat); • Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás; • Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans);

  10. Ismétlés vége

  11. Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia

  12. Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia [Molekula ION]- N+ Ion-párképző só Mérendő komponens ionos formája [Molekula ION]- N+ C18 szilárd fázis Ionpárképző reagens(Quaterneralkil ammónium só)

  13. Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia O O- [Molekula ION]+ S Ionpárképző só Mérendő komponens ionos formája O O [Molekula ION]+ S O- C18 szilárd fázis O Ionpárképző reagens(Alkilszulfonsav só) Esetleg: CF3COO-; BF4-; ClO4-, PF6-

  14. Ionpárképző mechanizmus (ioncserés modell) [ION]+ Na+ [ION]+ SO3-Na+ SO3- SO3-Na+ Módosított állófázis C18 szilárd fázis

  15. Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia • Az RP-IP_HPLC-ben változtatható paraméterek: • Ionpárképző koncentrációja; • Ionpárképző jellege (típusa, lánc hossza, stb.) • Szerves modifikátor típusa, mennyisége; • Puffer koncentrációja, pH-ja; • Idegen só koncentrációja;

  16. Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – a szerves fázis hatása

  17. Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa

  18. Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa

  19. Ioncserés folyadékkromatográfia

  20. Ioncserés folyadékkromatográfia Ioncsere: ha az állófázis állandó töltéssel rendelkezik; Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes ion mennyiség egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g); „Ioncserélő gyanták” • Ionkizárásos kromatográfia • Ionkromatográfia

  21. Ioncserélő töltetek KATION CSERÉLŐK Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, PO4-) ANION CSERÉLŐK Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner amino, imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal AMFOTER (kevert) TIPUSOK Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex szerkezettel ERŐS - GYENGE IONCSERÉLŐK DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT „TENTACLE” ELV - KAPACITÁS !

  22. Ionkizárásos folyadékkromatográfia Állófázis: nagy ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta; Eluens: puffer (ritkán kis szerves oldószer tartalommal); Alkalmazásai: fermentlevek, szeszesital, üdítőital gyártás (cukrok, savak, alkoholok elválasztása) HOOC-R HO-R Cukor SO-3 SO-3 -OOC-R pórus

  23. Ionkromatográfia A szervetlen anionok, kationok vagy vízben oldódó szerves savak és bázisok meghatározására használjuk Állófázis: kis ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta; Eluens: puffer; Detektor: vezetőképesség (elektrokémiai) ionelnyomó után.

  24. Ionkromatográfia

  25. Ionkromatográfia Visszatartást befolyásoló tényezők: • Növekvő pH • Nő a savak ionizációja – nő a visszatartás; • Csökken a bázikus vegyületek ionizációja – gyorsan eluálódnak; • Puffer erősség nő • Ioncserélő felületeken megnő a versengés – csökken a retenció; • Nő a hőmérséklet • Egyensúly kedvez a mozgó fázisnak – csökken a retenció.

  26. Ionkromatográfia

  27. Ionkromatográfia Szupresszió előtt Szupresszió után Vezetőképesség mS Idő (min)

  28. Ionkromatográfia Szupresszió ioncserés oszloppal (Regenerálni kell!!)cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése (S/N növelése) Cl- meghatározása Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens NaHCO3): Gyanta-H+  + Na+ HCO3  --> Gyanta-Na+  + H2CO3Gyanta-H+  + Na+ Cl-       -->  Gyanta-Na+  + HCl A mozgófázis vezetőképessége jelentősen csökken, az elválasztott ion vezetőképessége a Na ion (50 S*Cm2/equiv.) H ionnal (350 S*cm2/equiv.) történő cseréjével jelentősen megnő. Na+ meghatározása Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens HCl): Gyanta-OH- + H+ Cl-  -->  Gyanta-Cl- +   H2O Gyanta-OH- + Na+ Cl- --> Gyanta-Cl- +  Na+ OH- A mozgófázisból víz lesz, a mintában pediglecseréljük a Cl-(76 S*cm2/equiv) ionokat OH- ionokra (198 S*cm2/equiv).

  29. Ionkromatográfia Alkalmazás (Anion referencia oldat); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3 IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop

  30. Ionkromatográfia Alkalmazás (vízminta); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3 IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop

  31. Ionkromatográfia

  32. Ionkromatográfia 21 TERMÉSZETES AMINOSAV IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA Dionex DC-6A ANIONCSERÉLŐN (30X0,46 cm) 3 LÉPÉSES Na-citrát gradiens DETEKTÁLÁS: NINHIDRIN (post-column)

  33. Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia (Hidrophobic Interaction Chromatography, HIC)

  34. Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia

  35. Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia

  36. HIC vs. RPC Mindkét technikában közös és jellemző: - Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum. - A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás. - A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok határozzák meg. - Alkalmasak fehérjék elválasztására.

  37. HIC vs. RPC • KÜLÖNBSÉGEK: • - A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja. • A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a denaturáció esélye. • A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób jellege határozza meg. • - A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el. Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye. • A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis (ligandum) felelős, a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező

  38. Hidrofil kölcsönhatású folyadékkromatográfia (Hidrophilic Interaction Liquid Chromatography; HILIC)

  39. HILIC Állófázis: mint a normál fázisú kromatográfiában Eluens: mint a fordított fázisú kromatográfiában 3-40% vízzel (A víz az erős oldószer !!!) Alkalmazásai: RP-hez túl poláros, nehezen visszatartható komponensek elválasztására

  40. Detektorok

  41. A detektorok legfőbb jellemzői Szelektív – univerzális Dinamikus tartomány Linearitási tartomány Érzékenység Destruktív – nem destruktív

  42. Komponensek tulajdonságát észlelik A folyadékkromatográfiás detektorok • UV- látható abszorbancia detektor (UV- VIS) • Fluoreszcenciás detektor (FLD) • Elektrokémiai detektor (ECD) • Radiokémiai detektor (RD) • Tömeg detektorok (MSD) Előnyök: specifikusság, érzékenység, szelektivitás Hátrányok: minden vegyület más (pl. más UVmax)

  43. Mozgófázis tulajdonságát észlelik A folyadékkromatográfiás detektorok • Törésmutató detektor (RID) • Vezetőképesség detektor (CD) • Fényszórásos detektor (LSD) Előnyök : nagyon sok komponensre – majdnem univerzális Hátrányok: zaj, érzékenység

  44. UV-VIS detektor • Alapelv: Lambert-Beer törvény

  45. UV-VIS detektor Structure Chromophore max(nm) Amine - NH 195 2 Ethylene - C = C - 190 - Ketone C = O 195 - Ester - COOR 205 Aldehyde - CHO 210 Carboxyl - COOH 200-210 Nitro - NO 310 2 Phenyl 202, 255 Naphthyl 220, 275

  46. UV-VIS detektor – UV spektrum Benzamidofenol Abszorbancia(mAU) Paracetamol • Kromatográfiás elválasztás; • Minél magas hullámhossz annál szelektívebb • maxpH függése • oldószerek, adalékok UV elnyelése 280 nm 4 3 2 1 0 200 250 300 350 400 Hullámhossz (nm)

  47. UV-VIS detektor – UV Cutoff Solvent UV Cutoff (nm) Acetonitrile 190 UV cutoff is the wavelength at which absorbance equals 1, measured in a 1 cm cell with air as a reference. Water 190 Cyclohexane 195 Hexane 200 Methanol 210 Ethanol 210 Diethyl Ether 220 Dichloromethane 220 Chloroform 240 Carbon Tet 265 Tetrahydrofuran 280 (220) Toluene 285

  48. VWD – Variable Wavelenght detector A diffrakciós rács monokromatikus fényt állít elő A monokromatikus fényt megosztjuk a referencia és minta fotodióda között lencse tükör Diffrakciós rács tükör deutérium lámpa tükör Fénynyalábosztó Átfolyó cella tükör Minta fotodióda Az intenzitásbeli különbséget a cellában történő abszorbancia okozza

  49. Diódasoros detektor – DAD, Diodarray detector VisLamp AchromaticLens Diode Array DetectorFlow Cell UVLamp HomiumFilter Grating OpticalSlit

  50. Deutérium lámpa tesztje

More Related