Moleculaire klonering in planten Vectoren : planten Primros e & Twyman. : hoofdstuk 14

1. Moleculaire klonering in planten Vectoren : planten Primrose & Twyman. : hoofdstuk 14 Belangrijke facetten Wat hebben (hadden) we voorhanden? Bacterie-plant interactie Agrobacteriumtumefaciens *

2. Functionele kaart van het Ti plasmide pTiC58 noc : catabolisme van nopaline nos : biosynthese van nopaline tra : genen voor conjugatieve transfer (tussen bacteriën !) T-DNA : tumor DNA (of onc-gebied) D is het vir gebied (virulentie) : het operon met de functies nodig voor transfer van het T-DNA van de bacterie naar de plant.

3. Opines : aminozuurderivaten die door de plant gemaakt kunnen worden en door de bacterie gebruikt als C- en energiebron. Voorbeelden van opines : A) octopines B) nopalines C) agropine *

4. Herkenning van transformatie / selectie van transformanten : => weefselkweek van plantencellen vereist fytohormonen voor groei (auxine, cytokinine) => weefselkweek transformanten (kankercellen) groeien onafhankelijk van fytohormonen Dit is een natuurlijk selectiemiddel voor transformanten (kankercellen). => Echter : deze kankercellen zijn niet of zeer moeilijk te regenereren tot intacte planten. De gevormde tumoren hebben dus 2 basiskarakteristieken : => wildgroei karakter => synthese van een opine (aminozuurderivaat) Uiteraard is het niet interessant een transgene plant te hebben met tumoren. Dit moest dus uitgeschakeld worden.

5. Ti-plasmiden(natuurlijke DNA overdracht van bacterie Agrobacterium tumefaciens naar plant) Structuur plasmide : kenmerken ori, tra, vir, onc, opine synthese/afbraak Kenmerken (van de “natuurlijk getransformeerde” plant): - tumorvorming (crown-gall) : groei onafhankelijk van fytohormonen - aanmaak nieuw metaboliet : opine => het opine wordt gesecreteerd en kan gebruikt worden door de bacterie Infectie verwonde plant : interactie bacterie-plant - verwonding => fenolen e.a. => attractie bacteriën => contact plant-bacterie : chromosomaal gecodeerde genproducten => inductie van vir regio op Ti-plasmide : contact met VirA proteïne Overdracht tumor-DNA : LB en RB consensus sequenties (25 bp direct repeats) - membraaneiwit VirA : autofosforylatie - => fosforylatie VirG proteïne(bindt op regulator van vir-gebied) => expressie-activatie : VirD1, VirD2, VirE - VirD1, VirD2 : plaats-specifieke endonucleasen => nicks in dezelfde streng aan linker- en rechterzijde van het T-DNA => enkelstreng DNA : wordt verpakt in VirE proteïnen - VirD2 (pilooteiwit) : covalent gebonden aan het uiteinde - transfer naar de plantnucleus en covalente integratie in ‘willekeurige’plaatsen in het genoom

6. De RB en LB consensus sequenties : * De gebieden met hoogste homologie zijn (zwart) ingekaderd. Tussenin zijn er 2 bp zonder specifieke gelijkenissen. Nopaline L en R ‘border’ gebieden : in de Ti plasmiden pTiC58 en pTi37. In de octopine plasmiden is het tumorgebied in twee segmenten verdeeld : vandaar 4 ‘border’ gebieden. In de Ti plasmiden pTiAch5 en pTiA5955.

7. Schematische weergave van Agrobacterium-gemedieerde gentransfer van de bacterie naar de plant. De verwonde plant scheidt fenolische componenten af als onderdeel van een defensie- en wondhelingsstrategie. verdere beschrijving op volgende slide

8. Schematische weergave van Agrobacterium-gemedieerde gentransfer van de bacterie naar de plant. De verwonde plant scheidt fenolische componenten af als onderdeel van een defensie- en wondhelingsstrategie. (1) deze fenolische componenten leiden tot attractie van Agrobacterium tumefaciens (positieve chemotaxis) (2) de bacterie hecht zich aan de celwand van de plant (3) de fenolen worden herkend door het VirA eiwit van het Ti-plasmide (autofosforylatie) en (4) en (5) leidt tot fosforylatie van VirG (DNA bindend eiwit) dat het vir gebied activeert. (6) VirD eiwitten (plaats-specifieke ss-endonucleasen) knippen (nick) de onderste streng van het T-DNA (bij de LB en RB plaatsen) (7) De T-streng wordt verpakt in VirE eiwit en gepiloteerd door VirD naar de plant nucleus. OV (overdrive) stimuleert deze stap. (bij de octopine stammen.) (8) Het T-DNA wordt covalent geïntegreerd in het plantengenoom en tot expressie gebracht. Dit omvat genen die auxine en cytokinine laten aanmaken en tot permanente groei leiden (tumorvorming) (9) Het ocs of nos gen komt tot expressie en het opine wordt gesecreteerd ten voordele van de bacteriën die het als C, N en energiebron kunnen gebruiken in deze parasitaire interactie. Het vir-gebied wordt nietzelf overgedragen. Bij nopaline tumoren is het overgedragen gebied (T-DNA) ongeveer 22 kb ; bij octopine tumoren ongeveer 12 kb, of, in sommige gevallen, 2 segmenten : 13 kb + 7 kb.

9. Gebruik van Ti-plasmiden als vectoren Ontwapening van het Ti-plasmide : pGV3850 - RB en LB zijn voldoende als cis-element voor excisie en transfer (“overdrive” bij RB (in sommige Ti-plasmiden) intensifieert dit proces) - de genen die het tumoraal karakter bepalen spelen hierbij geen rol => vervanging van het (grootste deel van het) T-DNA door pBR322 Klonering in Ti-derivaten - transfer door co-integraat strategie - pBR322 sequenties in pGV3850 zijn doelwit voor homologerecombinatie in Agrobacteriumtumefaciens - het vir gebied blijft op hetzelfde plasmide Binaire benadering voor transfer - splitsing van de “functionele” gebieden : => 2 plasmiden - één zonder T-gebied (noch LB, RB), maar met de andere Ti-elementen - één met het te tranfereren gebied, geflankeerd door LB & RB (nb. nos of ocs kunnen als herkenningsmerker aanwezig blijven)

10. Structuur van het Ti plasmide, dat “ontwapend” is, m.a.w. waarin het T-DNA vervangen is door pBR322 (dat een doelwit voor homologe recombinatie is)

11. Vorming van een co-integraat met pGV3850 door homologe recombinatie. Het gebied tussen de driehoekjes ( ) wordt naar de plant overgedragen.

12. Basisstructuur vectoren : binaire benadering - selectiemerkers (E. coli, A. tumefaciens, plant), bacteriële ori’s - expressie-elementen (promotor, terminatiegebied) - eventueel herkenningsmerker of reporter (“scorable”)