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GENETICA FUNCIONAL

GENETICA FUNCIONAL. Estudio de la expresión de genomas completos. GENETICA FUNCIONAL. Bibliografía: Nature Genetics January 1999 Vol. 21, Supplement The Chipping Forecast. GENETICA FUNCIONAL.

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GENETICA FUNCIONAL

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Presentation Transcript

  1. GENETICA FUNCIONAL Estudio de la expresión de genomas completos

  2. GENETICA FUNCIONAL Bibliografía: Nature Genetics January 1999 Vol. 21, Supplement The Chipping Forecast

  3. GENETICA FUNCIONAL • 1) El entendimiento de los sistemas biológicos constituidos por miles de genes requiere la organización de las partes según sus propiedades: • + Similaridad de secuencia de DNA en las regiones codificantes y reguladoras • + Variaciones polimórficas entre especies y subgrupos • + Tiempo y lugar de expresión de los RNAs en el desarrollo, en respuesta a situaciones fisiológicas y/o patológicas. • + Localización subcelular de los productos génicos. • 2) Este entendimiento precisa el desarrollo de técnicas de "visión global" de los procesos biológicos: estimación simultanea de todos los componentes. • + DNA chips (o DNA microarrays) • + Serial Analysis of Gene Expresion (SAGE) • + Differential Display (Expresión diferencial). • 3) Estas técnicas permiten estudiar en paralelo los niveles de expresión de muchos genes y generan información estática (donde se expresa un gen) y dinámica (como se relaciona la expresión de unos genes con otros).

  4. DNA Chips o DNA Microarrays 1) Evolución histórica: + Técnica de Shouthern: "Las moléculas de ácido nucleico marcadas de forma apropiada puede usarse para extraer información de muestras de de ácidos nucleicos fijadas a un soporte sólido": Técnicas de Shouthern, Northern, dot-blot, Slot-blot, etc. + Fijación de clones individuales de forma ordenada en filtros para localizar los clones deseados e investigar patrones de expresión de genes. 2) Innovaciones clave: A) Utilización de soportes sólidos no-porosos, que permiten la miniaturización y la detección fluorescente. + Pueden inmovilizarse de forma automática hasta 10.000 cDNAs en un soporte microscópico e hibridarlo con sondas marcadas. B) Desarrollo de métodos de síntesis in situ y a alta densidad, de oligonucleótidos en dichas superficies. + Mediante técnicas fotolitográficas: matrices con 400.000 oligonucleótidos distintos cada uno confinado en una región de 20 µm2 + Mediante la colocación in situ de los reactivos de síntesis por dispositivos similares los utilizados en las impresoras de chorro de tinta. 3) Usos propuestos: A) Análisis de niveles de expresión de RNAs. + cDNA arrays: Producidas por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos. +Oligonucleotide arrays: Idem pero por síntesis in situ de oligonucleótidos B) Análisis de variantes polimórficas en DNA y nuevas mutaciones (SNPs- Single Nucleotide Polymorfisms). + Oligonucleotide arrays: Para secuenciación en paralelo.

  5. Affymetrix

  6. Chip de vidrio

  7. cDNA microarray schema

  8. Impresión o “espoteo” • Oligos , cDNA o fragmentos de PCR depositados sobre una superficie de vidrio

  9. Pen microarray robot

  10. Pen microarray robot

  11. Estación automática de hibridación

  12. Modelo de DNA array

  13. Light directed oligonucleotide synthesis

  14. Light directed oligonucleotide synthesis

  15. 40,000 genes en una única matriz

  16. Usos propuestos para los DNA Chips o DNA Microarrays A) Análisis de niveles de expresión de RNAs. + cDNA o oligonucleotide arrays: Producidas por fijación de productos de PCR (0.6 a 2.4 Kb) que representan genes específicos. B) Secuenciación + Oligonucleotide arrays C) Genotipado + Oligonucleotide arrays

  17. Bacteria grown in culture Label cDNA from bacteria with red Cy3 dye Bacteria from sit of infection. Label cDNA from bacteria with green Cy5 dye co-hybridization of cDNAs to DNA microarray RNA binds to corresponding gene cDNA microarray Blank-not expressed Green- expressed in infection only Red- expressed in culture only Yellow- expressed in Both, culture and infection

  18. Simulación de detección

  19. An hybridized microarray

  20. cDNA Microarrays Quantitation

  21. cDNA Microarrays Detection Limits

  22. Estrategias de secuenciación con chips de DNA

  23. Oligonucleótidos utilizados en secuenciación por ganancia de señal

  24. Sequence analysis arrays

  25. Secuenciación y genotipado

  26. Secuenciación y genotipado

  27. Genotipado Matríz con 120.000 sondas diseñada para genotipar 3.000 loci bialélicos

  28. SAGE Serial Analysis of Gene Expression

  29. SAGE • Una secuencia de nucleótidos corta (tag) de 9 o 10 pares de bases contiene suficiente información para identificar un transcrito.

  30. Cleave with anchoring enzyme (AE) Bind to streptavidin beads AAAAA AAAAA A A A A A TTTTT TTTTT T T T T T G T A C G T A C CATG CATG AAAAA AAAAA GTAC GTAC TTTTT TTTTT Divide in half Ligate to linkers (A+B) CATG CATG AAAAA AAAAA GTAC GTAC TTTTT TTTTT Cleave with tagging enzyme (TE). Blunt Ends Ligate and amplify with primers A and B A A A A A T T T T T Cleave with anchoring enzyme Isolate Ditags. Concatenate and clone O O O O O O O O O C A T G O O O O O O O O O G G A T G C A T G X X X X X X X X X G G A T G C A T G O O O O O O O O O Primer A Primer B C C T A C G T A C X X X X X X X X X C C T A C G T A C O O O O O O O O O T E A E T a g T E A E T a g G G A T G C A T G X X X X X X X X X O O O O O O O O O C A T G C A T C C Primer A Primer B C C T A C G T A C X X X X X X X X X O O O O O O O O O G T A C G T A G G T E A E A E T E D i t a g G G A T G C A T G X X X X X X X X X C A T C C Primer A Primer B C C T A C G T A C G T A G G G T A C X X X X X X X X X C A T G X X X X X X X X X O O O O O O O O O C A T G X X X X X X X X X O O O O O O O O O C A T G G T A C X X X X X X X X X O O O O O O O O O G T A C X X X X X X X X X O O O O O O O O O G T A C A E T a g 1 T a g 2 A E T a g 3 T a g 4 A E D i t a g D i t a g AE is Nia III TE is Fok I

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