PAPEL DA APOPTOSE NA LEISHMANIOSE HUMANA. INTERA ÇÃ O MOLECULAR COM O HIV

1. Fundação Oswaldo Cruz PAPEL DA APOPTOSE NA LEISHMANIOSE HUMANA. INTERAÇÃO MOLECULAR COM O HIV Dra. Maria Lourdes Farre Vallve LIMI-CPqGM-FIOCRUZ

2. LEISHMANIOSE • Doença infecto-parasitária causada por um protozoário da família Trypanosomatidae, gênero Leishmania • 2 milhões de casos novos a cada ano - entre as seis endemias mais importantes do mundo (OMS). • Importante problema de saúde pública no Brasil e 88 outros países do mundo • Apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas e imuno-patológicas: • Cura espontânea da lesão cutânea • Forma cutânea localizada • Forma cutâneo-mucosa • Forma Visceral características genéticas e da resposta imunológica do hospedeiro Depende da espécie de Leishmania X envolvida

3. CO-INFECÇÃO HIV-LEISHMANIA • Afeta 34 paises • 3a co-infecção associada ao HIV • Principalmente associada a leishmaniose visceral • A co-infecção piora o estado clínico do paciente, sendo que o HIV aumenta o risco de apresentar leishmaniose e a Leishmania acelera o processo da AIDS. • Aumenta a mortalidade em comparação com os indivíduos unicamente infectados por HIV. • A co-infecção dificulta o diagnóstico sorológico. • A infecção pelo HIV está internalizando para as áreas rurais no Brasil a co-infecção afeta as áreas endêmicas de leishmaniose na Bahia?

4. APOPTOSE: Morte celular programada Inicia-se: Receptores de morte Executa-se: caspases Regula: prot. família Bcl-2 APOPTOSE E LEISHMANIOSE No modelo murino, a expressão de Fas/FasL demostrou-se crucial na resistência à infecção pela L. major (Conceição-Silva et al., 1998; Huang et al., 1998). Em humanos (pouca informação): Leishmaniose visceral: Fas e FasL elevados no plasma e retornam a valores normais pós-cura (Eidsmo et al., 2002). Leishmaniose cutânea: a via Fas-FasL é necessária para resolução da lesão (Sami et al., 2001). Infecção in vitro: a L. donovani regula a apoptose do neutrófilo e macrófago para assegurar a sua sobrevida (Aga et al, 2002; Moore et al, 1994).

5. HIPÓTESES A apoptose é um processo celular importante no estabelecimento e resolução da leishmaniose humana. Nas áreas endêmicas de leishmaniose na Bahia existem casos de co-infecção HIV/Leishmania. OBJETIVO GERAL Estudar o papel da apoptose na leishmaniose humana, incluindo os casos de leishmaniose que apresentem co-infecção com HIV. • OBJETIVOS ESPECIFICOS: • 1. Estudar a regulação molecular da apoptose ex vivo e in vitro em células mononucleares de pacientes com leishmaniose tegumentar americana. • Estudar a incidência da co-infecção HIV/Leishmania e a possível alteração destas vias moleculares pela coexistência dos dois agentes infecciosos em indivíduos co-infectados. • Correlacionar os dados moleculares obtidos com os dados clínicos.

6. Coleta sangue METODOLOGIA Dados clínicos Banco de dados Parafina: H/E diagnostico IHQ Biopsia Paciente LTA RNA 2a coorte 1a coorte PBMC Plasma proteína ELISA: Fas FasL Citometria de fluxo DNA CBA: Caspase-3 Bcl-2 PARP Sorologia: HIV Leishmania Polimorfismo gene FAS Analise Bayesiano

7. Dados clínicos Coleta sangue Coleta sangue Banco de dados Paciente leish. visceral ELISA: Fas FasL Plasma DNA Controle sadio RNA 2a coorte 1a coorte PBMC Plasma proteína ELISA: Fas FasL Citometria de fluxo DNA CBA: Caspase-3 Bcl-2 PARP Polimorfismo gene FAS

8. RESULTADOS

9. CONSTRUÇÃO DE BANCOS DE DADOS E AMOSTRAS • Construção de um banco de dados e amostras de leishmaniose tegumentar americana (LTA). • 181 pacientes • Dados demográficos e clínicos. • Plasma, DNA, RNA, proteína e biopsia de lesão 2. Construção de um banco de dados e DNA de leishmaniose visceral (colaboração UFMa). 1000 crianças (com manifestação clínica, DTH+ e controles sadios) Dados demográficos e clínicos. Plasma e DNA

10. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS COM A APOPTOSE NA LTA: receptor de morte celular FAS Análise da expressão ex-vivo do receptor Fas na superficie celular em pacientes com LTA Aumento significante de neutrófilos, monócitos e linfócitos Fas positivos nos pacientes de LTA a respeito dos controles normais. Correlação entre a expressão de Fas e as células mieloides somente nos controles normais (p=0.0029, r=0.83) mais não nos pacientes com LTA. RELEVÂNCIA CLÍNICA ??

11. CORRELAÇÃO EXPRESSÃO DE FAS COM DADOS CLÍNICOS A expressão de Fas na superfície dos linfócitos correlaciona-se negativamente com o tempo de cura. RR=6.67 (95% IC 1.03-43.19) p=0.026 (Fisher’s test) Risco relativo seis vezes maior de aumento do tempo de cura nos pacientes que expressam menos FAS. Não observamos associação com a resposta imune humoral (anti-leishmania IgG) ou celular (DTH)

12. 2a coorte (n=X) confirma-se os resultados da primeira coorte. Aplicação do análise de redes bayesiana (análise de associação multifatorial - dados laboratoriais e clínicos): Expressão de Fas associa-se com o número de ciclos de tratamento requeridos. Treatment cycles CD95 Existem fatores genéticos associados?? MARCADOR DE RESPOSTA TERAPÊUTICA Expressão de Fas na superficie dos linfocitos

13. PAPEL DO POLIMORFISMO -670 DO GENE FAS NA LTA. * * * ** * Polimorfismo funcional na região promotora do gene FAS situado na seqüência de ativação por interferon-gama (GAS, STAT1 binding site). Análise por RFLP: substituição CCAGAAACCAGGAA RESULTADOS: Não observamos diferenças nas freqüências dos genotipos entre os pacientes de LTA e os controles normais  não contrubui com a susceptibilidade. AA funcional GA heterozigotos GG não funcional Associação com a severidade  o genotipo AA (funcional) esta associado com um tempo de cura menor e menor requerimento de ciclos de tratamento com antimonial pentavalente.

14. Análise Bayesiana confirma a associação entre o genótipo de FAS, os ciclos de tratamento e o tempo de cura Healing time Treatment cycles Fas genotype O polimorfismo –670 do gene FAS esta associado com a severidade da doença  candidato a marcador farmacogenêtico para a resposta a antimoniales na LTA. A evolução clínica da LTA é um processo multifatorial com interações complexas entre sexo, idade, fatores genéticos e resposta imune.

15. ANÁLISE DA REGULAÇÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS COM A APOPTOSE NA LTA: caspase-3, Bcl-2 e PARP Controles sadios Pacientes LTA Extrato protéico de PBMC (2a coorte) - Técnica CBA Caspase-3  ativação PARP  clivagem Bcl-2  expressão • Diminuição significativa da expressão de Bcl-2 (proteína anti-apoptotica) nos pacientes com LTA em comparação com os controles sadios. • Diminuição da ativação da caspase-3 (efetora da apoptose) nos pacientes com LTA, mas sem diferenças no clivagem de PARP (substrato da caspase-3)  dúvida: marcador de apoptose ou ativação celular ??? Proximo passo: estudo da regulação destas proteínas nas populações celulares isoladas.

16. RESULTADOS V Sorologia HIV pacientes área endêmica de Jiquiriçá • 124 pacientes testados • 2 pacientes positivos e 2 no cut off (duplicados). Para descartar falsos positivos (pois a presença de Leishmania pode interferir no teste)  Detecção do RNA do vírus. Projeto aprovado e financiado na Chamada para pesquisas clínicas e clínico-epidemiológicas em DST/HIV/Aids. Convocatória n 1/2005 – Ministério da Saúde – UNESCO Relação Parasita-Hospedeiro na co-infecção HIV x Leishmania sp e sua evolução para a Leishmaniose Tegumentar. Avaliação da co-infecção HIV-Leishmania numa população de 4000 indivíduos das áreas endêmicas de Jiquiriçá (Fazenda Bom Jesus) e Jequié (Florestal) - Ba.

17. TRABALHOS EM ANDAMENTO • Análise dos níveis de Fas e Fas L solúveis por ELISA • Análise do polimorfismo -670 do gene Fas na coorte de leishmaniose visceral • Estudos in vitro da regulação das vias de apoptose na infecção in vitro de macrófagos humanos. • PERSPECTIVAS • Análise de Fas e Fas L na lesão (IHQ da biopsia) • Estudo da inicidência da co-infecção HIV/Leishmania nas áreas endêmicas de Jiquiricá e Jequié (projeto aprovado e financiado). • Estudos ex vivo e in vitro da interação HIV/Leishmania.

18. Publicacões e apresentacões a congressos Lymphocyte Fas (CD95) expression can predict therapeutic response in human cutaneous leishmaniasis. Lourdes Farré, Gilvanéia Silva Santos, George Soares, Jackson M Costa, Aldina Barral, Manoel Barral-Netto & Johan Van Weyenbergh Submetido no Cell Death and Differentiation. Apresentações em congressos: Immunogenetic and pharmacogenetic analysis of FAS (TNFRf6) -670 promoter polymorphism in cutaneous leishmaniasis. Santos, G.S. ; Farre, L ; Deforche, k. ; Soares, G ; Barral-Neto, M ; Van Weyenbergh J . XXX meting of the Brazilian Society of immunology, 2005, São Paulo. Efeito diferencial de IFN-beta e L.amazonensis em macrófagos e células NK. Bafica AM, Farre L, Van Weyenberg J. Jornada de iniciação científica do nordeste-2004, Recife. Comunicação oral. Efeito diferencial de IFN-beta e l. amazonensis em macrofagos e celulas NK humanas XXIII Seminário Estudantil de Pesquisa. Bafica AM, Farre L, Van Weyenberg J. UFBA, 2004,Salvador. Fas expression in PBMC of patients with localized cutaneous leishmaniasis - correlation with clinical data. Silva G, Farre L, Soares G, Barral A, Barral-Netto M, Van Weyenbergh J. Meeting of the Brazilian Society of Immunology. 5-8 outubro 2003. Mangaratiba (RJ).

19. Orientações concluídas: Estudo do polimorfismo –670 e da expressão do gene Fas na leishmaniose cutânea: possível associação com dados clínicos. Tese de mestrado (co-orientação). Curso de Pós-graduação em Patologia UFBA-FIOCRUZ 2004 Aluna: Gilvanéia Silva Santos. Especialização: Adriana Santos Almeida, Aline Clara da Silva. Iniciação cientifica: Bruna Orientações em andamento: Doutorado: Gilvanéia Silva Santos (Co-orientação) Mestrado: Aline Clara da Silva

20. EQUIPE COLABORADORES Dra. Isolda Casanova Dr. Ramon Mangues Hospital de Sant Pau Barcelona - Espanha Kul Deforche Dra. Anemie Vandamme Univestidade Católica de Lovaina – Bélgica Adriana Santos Almeida Gilvaneia Silva Santos George Mariani Soares Aline Clara da Silva Dra. Maria Lourdes Farre Vallve Dr. Johan Van Weyenbergh Dr. Jackson Costa Mauricio Dra. Aldina Barral Dr. Manoel Barral-Netto Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz FIOCRUZ - Bahia