TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EM PLANTAS

1. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EMPLANTAS Luciano da Silva Pinto Doutorando em Biotecnologia ls_pinto@hotmail.com

2. Definição É a introdução controlada de ácidos nucléicos em um genoma receptor, excluindo-se a introdução por fecundação

3. Usos da Transformação de Plantas • A. Testar a função de genes ou partes de genes • B. Modificar a expressão de genes endógenos • Desligar genes • Aumentar a expressão • Modificar a expressão • C. Mover genes entre organismos.

4. Aplicações • Resistência a insetos: • uso de inibidores de proteinases, • toxinas bacterianas (gene Bt )-Milho, algodão, batata e soja • Tolerância a herbicidas: • Soja Roundup Ready , • Milho, Cana-de-açúcar e Eucalipto • Resistência a vírus: • os gene da capa protéica ou capsídeo do próprio vírus foi introduzido na planta, funcionando assim como uma espécie de "vacina". • Alteração de coloração de flores: • envolvidos de rotas bioquímicas

5. Alteração da qualidade nutricional: • Empresa Calgene obteve óleos ricos e ácido esteárico, um ácido graxo saturado, • arroz que produz beta- caroteno, precursor de vitamina • Produção de vacinas: • Batata, tabaco, banana e alface. • PLANTICORPOS - Cuba

6. Possíveis Impactos no Meio Ambiente • Poluição genética ou contaminação gênica de espécies silvestres • Fluxo gênico: transgene população silvestre • Cultivos próximos de parentes silvestres Cevada, alface, arroz, aveia, batata, sorgo e trigo • Reações alérgicas ou de hipersensibilidade • Reações de intolerância – alterações fisiológicas, como reações metabólicas anormais e toxicidade

7. Etapas da Produção de Plantas Transgênicas - Identificação e isolamento do gene; - transferência do gene; - seleção das células que contenham o gene transferido; - regeneração de plantas; - expressão do gene nas plantas adultas.

8. TGTGAACACACGTGTGGATTGG... Isolamento de genes • Busca de genes de interesse em bancos de dados; • Construção de primers e amplificação por PCR; • Quantificação e sequenciamento.

10. Cassete de Expressão = região promotora = região terminadora

11. Promotores e terminadores mais utilizados Promotores constitutivos • CaMV 35S : 35S do vírus do mosaico da couve-flor • pNOS: Nopalina Sintetase do pTiC58 de A. tumefaciens Promotores Orgão/ tecido específico • Vicilina, glutenina: específicos para expressão em sementes • pPATATIN: tubérculos de batata • RuBisCo: tecido clorofilado • pLECTINA: expressão em sementes de feijão • Promotores induzidos • phsp70 : "Heat shock gene" de milho Terminadores • 3'OCS: Octopina sintetase do pTiB6S3; • 3'NOS:Nopalina sintetase do pTiC58; • 3'G7 : Gene 7 do pTiAch5 

15. Estratégias mais utilizadas de transferência de DNA para plantas • Vetor biológico: • Agrobacterium (uma bactéria do solo com duas espécies importantes: A. tumefaciens e A. rhizogenes) • Vetores virais: O CaMV permite inserções de no máximo 0.8 Kb. POUCO USADO Transferência direta: De protoplastos - A membrana celular é permeabilizada por choques eléctricos ou agentes permeabilizantes (como o polietilenoglicol) – eletroporação Plantas intactas - Bombardeamento com micropartículas, de ouro ou tungstênio (com cerca de 1 μm de diâmetro)

16. Transformação via vetor natural • Agrobacterium tumefaciens rhizogenes Transferência natural de DNA para plantas

17. Plasmídio Ti

19. Representação esquemática da interação Agrobacterium-planta 1) injuriada e liberação de compostos fenólicos pela célula vegetal; 2) ligação de Agrobacterium à superfície da célula, mediada por proteínas bacterianas e vegetais; 3) interação de composto fenólico com a proteína VirA; 4) fosforilação da proteína VirG; 5) ativação da transcrição dos genes de virulência (genes vir); 6) formação da fita-T, ligada à proteína VirD2; 7) produção da proteína VirE2; 8) organização do complexo-T (fita-T, VirD2 e VirE2); 9) transferência do complexo-T para a célula vegetal; 10) entrada do complexo-T no núcleo celular; 11) integração do T-DNA ao genoma celular. (modificado de Sheng & Citovsky,1996).

20. Representação esquemática de um plasmídeo Ti/Ri e da estratégia usada para a transferência de genes no sistema de transformação via Agrobacterium com vetor binário pTi, plasmídeo indutor de tumor de A. tumefaciens; pRi, plasmídeo indutor de rizogênese de A. rhizogenes; Região vir, região de virulência; Região-T, região (DNA) transferida; BD, borda direita da região-T; BE, borda esquerda da região-T.

21. AGROBACTERIUM - Desvantagens Genótipo-específico (planta - bactéria) Monocot X Dicot Dependência do sistema de regeneração

22. MÉTODOS DIRETOS DE TRANSFORMAÇÃO Dois grupos: • aqueles que se utilizam de células desprovidas de parede celular (protoplastos) • e aqueles que possibilitam a transformação de células intactas ou tecidos. Em ambos métodos, o gene de interesse juntamente com o marcador seletivo e/ou repórter são transferidos como constituintes de um pequeno plasmídio de E. coli.

24. Obtenção de protoplastos Um protoplasto é uma célula "nua": perdeu a parede, mantém a membrana e adquire aspecto circular. A perda da parede celular é conseguida pelo uso de enzimas capazes de a degradar (ex.: celulase).

26. MICROINJEÇÃO

28. Biobalística Micro partículas de ouro Equipamento Processo

30. Vantagens Diversos protocolos de cultura de tecidos Não exige vetores especializados Transformação de organelas Rapidez e simplicidade Desvantagens Equipamento especializado Integração múltipla de transgenes Variabilidade do processo

31. Genes de seleção de transformantes • Genes marcadores para resistência a antibiótico. • Os mais utilizados são: • Gene neo: isolado do traposon Tn5 de Escherichia Coli, codifica para • a enzima neomicina fosfotransferase II (NPT II). Resistência a canamicina • Gene hpt: codifica para a enzima higromicina fosfotransferase (HPT) foi isolado • de Escherichiacoli e confere resistência ao antibiótico higromicina. Resistência a algum herbicida. Os mais utilizados são: • Gene csrl: codifica para uma forma alterada da enzima sintase do ácido acetohidroxil • (AHAS), também conhecida como acetato sintase (ALS). • Gene aroA: foi isolado de Salmonela tyhimurium tratada com mutagênico e selecionada • para a resistência ao herbicida glifosato. • Gene bar: clonado de Streptomyces hygroscopicus, codifica para a enzima fosfinotricina • acetiltransferase (PAT), que inativa o herbicida fosfinonotricina (PPT).

32. GENES REPÓRTERES • genes nos e ocs: foram isolados do T-DNA de Agrobactérium e codificam para a síntese da neopalina (NOS) e para a síntese de octopina (OCS), respectivamente. • Gene lacZ: foi isolado de Eschirichia coli e codifica para a B-galactosidase, más é pouca usado em plantas porque estas possuem uma alta atividade endógena de B-galactosidase, de difícil quantificação. • Gene cat: codifica a enzima clorafenicol acetiltransferase (CAT), que não é encontrada normalmente em plantas. Bastante usado em plantas, apesar da utilização de radioatividade. • Gene neo: O NPT II usado também como gene marcador de seleção. • Gene luc: codifica para luciferase de Photinus pyralis e tem sido usado como gene repórter em plantas. • Gene uidA: este gene foi isolado de Escherichia coli e é o gene repórter mais utilizado atualmente. Ele codifica para a B-glucuronidase GUS. • Gene gfp: foi isolado de Aequorea victória (medusa) e codifica para a ‘grenn fluorescent protein’ (GFP).

33. Epicótilo alongado cocultura Formação pró-gemas Multiformação de pró-gemas Multibrotação

34. Gene uidA

36. Tipos de transgênicos

37. Primeira geração – Características agronômicas • São aqueles que já existem no mercado mundial, obtidos com o objetivo de melhorar características agronômicas como a resistência a insetos e doenças e a tolerância a herbicidas. Estes produtos, na maioria dos casos trazem muitos benefícios ao produtor, como por exemplo: • aumento de produtividade; • diminuição de custos de produção, por meio da redução do uso de defensivos agrícolas e combustível; • melhoria da qualidade do produto final, com menores índices de fungos e micotoxinas;

38. Segunda geração – Qualidade alimentar • São aqueles que já estão sendo pesquisados e incluem os alimentos com maior qualidade (maior teor de nutrientes por exemplo) e que trazem benefícios também ao consumidor, tais como: • Alimentos com maior teor de proteínas e minerais (como o ferro); • Óleos com teores mais elevados de ácidos graxos do tipo ômega 3 (mais saudáveis).

39. Terceira geração – Produtos especiais • Ainda em fase de desenvolvimento, são os produtos de utilização farmacêutica (vacinas, hormônios, proteínas humanas, biorretores) e industrial (plásticos biodegradáveis e lubrificantes).

40. Alguns exemplos de plantas geneticamente modificadas • Tomate longa vida Flavr Savr, produzido pela companhia norte-americana Calgene, com o objetivo de obter frutos com maior conservação. Este tomate transgênico foi o primeiro produto liberado comercialmente para consumo nos Estados Unidos, em 1994. - Tomate com maior teor de licopeno, pigmento que dá a cor avermelhada ao fruto, é uma substancia antioxidante, que atua no organismo contra vários tipos câncer.

41. Arroz dourado, contendo alta concentração de pró-vitamina A. • A proeza, realizada por pesquisadores da Suíça e Alemanha, foi possível pela introdução de três genes envolvidos na síntese de beta-caroteno (pigmento vegetal), encontrados em uma flor (o narciso-dos-prados), em plantas de arroz.

42. Arroz contendo maior concentração de ferro nos grãos, para uso na alimentação humana e animal.

43. Soja Roundup Ready (RR) da Monsanto, resistente ao herbicida glifosato. Esta soja traz benefícios ao produtor, pois reduz a aplicação de herbicidas e mão-de-obra, elimina as plantas competidoras, resultando num aumento de produtividade.

44. Milho e algodão Bt, resistentes a insetos (certo tipo de lagarta). Estas plantas contém um gene proveniente da bactéria Bacillus thuringiensis, muito comum na natureza, e há muitas décadas usada como inseticida natural, principalmente na agricultura orgânica. Os principais benefícios ao agricultor são a redução do uso de inseticidas, o aumento da produtividade e a qualidade do produto final.

45. Tomate transgênico com altas doses de antioxidantes protegem contra o câncer • Tomate com mais licopeno, • Vacinas,

48. Produtos em desenvolvimento • Quanto aos produtos que estão sendo pesquisados e desenvolvidos no Brasil, ainda em caráter experimental, tem-se: • milho com maior teor de metionina no grão (EMBRAPA); • melão com maior potencial de conservação (UFPEL); • feijão resistente ao vírus do mosaico dourado (EMBRAPA/CENARGEN); • laranja resistente ao cancro cítrico (IAPAR); • batata resistente ao vírus do mosaico PVY (EMBRAPA Hortaliças, CENARGEN e UFPEL); • soja brasileira resistente ao herbicida glifosato (Roundup) (EMBRAPA Trigo); • mamão resistente ao vírus da mancha anelar (EMBRAPA/CENARGEN), o qual foi recentemente liberado pelo Ministério do meio Ambiente para avaliação a campo.

49. Área global histórica de cultivos transgênicos A área plantada com transgênicos cresceu 12% em 2007, com valores globais chegando a 700 milhões de dólares. 

50. Área global de cultivos transgênicos por característica genética Cultivos com duas ou mais características genéticas transgênicas e são se tornando cada vez mais populares, ganhando daquelas variedades que mostram apenas resistência a insetos.