10 likes | 169 Views
Praca magisterska wykonana w Pracowni Peptydów Wydziału Chemii Uniwersytetu Warszawskiego. Kierownik i opiekun pacy: prof. dr hab. Jan Izdebski. Monika Siemieniuk-Juzwiuk. Synteza analogu α -neo-endorfiny. Dwuetapowa synteza chronionej homoargininy.
E N D
Praca magisterska wykonana w Pracowni Peptydów Wydziału Chemii Uniwersytetu Warszawskiego Kierownik i opiekun pacy: prof. dr hab. Jan Izdebski Monika Siemieniuk-Juzwiuk Synteza analogu α-neo-endorfiny Dwuetapowa synteza chronionej homoargininy. Wprowadzenie reszty homoargininy do łańcucha peptydowego można wykonać poprzez syntezę peptydu z zastosowaniem odpowiednio chronio-nej pochodnej homoargininy. Opracowano szereg pochodnych skutecznych w procesie guanidylowania m.in. pochodne S-metylo-izotiomocznika, które wprowadzone zostały po raz pierwszy w Pracowni Peptydów Uniwersytetu Warszawskiego. Etap I: Synteza reagentu guanidylujacego. Syntezę homoargininy rozpoczełam reakcją pochodnej S-metylo-izotiomoczn-ika z N-(o-Cl-Cbz)-suksynoimidem w mieszaninie wody i dioksanu w obecno-ści wodorotlenku sodu. Otrzymałam N,N’-bis-(o-Cl-Cbz)-S-metylo-izotiomocz-nik. Synteza [ 6-Har ]-α-neo-endorfiny. Syntezę prowadziłam metodą Merryfilda na żywicy Nα-t-Boc-Nε-(2-CHLORO-CBZ)-L-LYSINE PAM resin ester o wzorze: Do syntezy peptydu użyłam następujących chronionych w łańcuchachbocz-nych pochodnych aminokwasowych: Boc-Pro, Boc-Tyr-(2-Br-Z), Boc-Lys-(2-Cl-Z), N -Boc-N N –bis-(o-Cl-Cbz)-Har, Boc-Leu,Boc-L-Phe, Boc-Gly-OH. Do wszystkich operacji mieszania, przemywania i sączenia stosowałam azot – gaz obojętny. Stosowałam 3-krotny molowy nadmiar pochodnych amino-kwasowych. Sprzęganie prowadziłam metodą karbodiimidową. Jako odczyn-nika sprzęgajacego użyłam dicykloheksylokarbodiimidu. DCC użyłam w sto-unku molowym 1:1 względem pochodnej aminokwasowej. Syntezę prowadziłam zgodnie z następującą procedurą: a) przemywanie dichlorometanem b) deprotekcja 55% roztworem kwasu trifluorooctowego (TFA) w dichlorometanie c) przemywanie dichlorometanem, 25% dioksanem w dichlorometanie, dichlorometanem d) neutralizacja 5% diizopropyloaminą w dichlorometanie e) przemywanie dichlorometanem f) neutralizacja 5% diizopropyloaminą w dichlorometanie g) przemywanie dichlorometanem h) reakcja sprzęgania przy użyciu równomolowej mieszaniny pochodnej aminokwasu i dicykloheksylokarbodiimidu i) przemywanie dichlorometanem, przygotowanie do testu Kaisera Po zakończeniu każdej kolejnej reakcji sprzęgania dokonywałam oceny stopnia acylowania przy pomocy ninhydrynowego testu Kaisera. Strukturę otrzymanego dziesięciopeptydu przedstawia poniższy wzór: Po wysuszeniu peptydopolimeru w eksykatorze próżniowym rozpo-czełam zdejmowanie peptydu z żywicy przy pomocy ciekłego fluoro-wodoru. Reakcję prowadziłam przez godzinę w 0°C z dodatkiem ani-zolu. Po upły-wie tego czasu fluorowodór odpędziłam pod próznia. Peptyd z żywicą suszyłam w eksykatorze próżniowym nad KOH w czasie jednej godziny. Następnie przemywałam je eterem w celu po-zbycia się anizolu. Peptyd ekstrachowałam roztworem kwasu octow-ego i liofilizowałam. W ten sposób otrzymałam 124 mg surowego peptydu. Widmo masowe wyizolowanego produktu wykazało obecność pików: M + 1H+ 1244 oraz M + Na (1243 + 23,4)1266,2 Rys. Widmo masowe [6-Har]-α-neo-endorfiny. N,N'-bis(-o-Cl-Cbz)-S-metylo-izotiomocznik Etap II: Guanidylacja Nα – Boc – lizyny. N,N’–bis-(o-Cl-Cbz)-S-metylo-izotiomocznik poddałam reakcji z Nα -Boc-Lizyną, w wyniku której powstała Nα -Boc-NωNω’–bis-(o-Cl-Cbz)-homoargi-nina. Wyizolowany analog zostal oddany na badania biologiczne oraz konformacyjne. Wyniki tych badań przedstawia tabela: Tabela .Aktywność opioidowa [6- Har] -α - neo-endorfiny i Leu –enkefaliny oznaczana in vitro w teście GPI i MVD. Wyniki testów na aktywność opioidową [6-Har]-α-neo-endorfiny w od-niesieniu do Leu-enkefaliny wykazały, że analog α-neo-endorfiny jest dwa razy mniej aktywny niż α-neo-endorfina, jakkolwiek wartość jego aktywności jest wysoka. Ponadto testy wykazały, że [6-Har]-α-neo-endorfina jest 12 razy bardziej aktywna w przypadku jelita świnki mor-skiej i 3 razy mniej aktywna w przypadku nasieniowodów myszy w po-równaniu do Leu-enkefaliny. Może to świadczyć o tym, że [6-Har]-α-neo-endorfina jest bardziej selektywna w stosunku do receptorów μ. Nα - Boc - NωNω' - bis - ( -o-Cl-Cbz ) -homoarginina Otrzymana przeze mnie pochodna zawierała zanieczyszczenia. W celu pozbyciasię ich posłużyłam się metodą klasycznej chromatografii kolumnowej. Proces oczyszczania prowadziłam w normalnym układzie faz, gdzie fazą stacjonarną był żel krzemionkowy o średnicy ziarna 0,04-0,06mm a fazą ruchomą była mieszani-na zawierająca metanol w chloroformie (elucja gradirntowa). Przed odłączeniem peptydu od żywicy usunęłam grupę t-butoksykarbo-nylową (Boc-), która zabezpieczała grupę aminową łańcucha głównego tyrozyny. Odbezpieczanie przeprowadziłam przy pomocy 55% roztworu TFA w dichlorometanie.