CROMATOGRAFÍA (parte I)

CROMATOGRAFÍA (parte I) Graciela Escandar

TEMAS A DESARROLLAR • Conceptos generales • Clasificación • La elución en cromatografía en columna • Resolución • Sistemas cromatográficos (reparto, adsorción, intercambio iónico y exclusión molecular) • Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) • Cromatografía de gases

Origen A principios del siglo XX, el botánico ruso Tswett separó pigmentos vegetales pasando soluciones de estos pigmentos por una columna de vidrio empaquetada con CaCO3. Las especies separadas aparecían como bandas de colores, lo que dio origen al nombre del método chroma= color graphé = escribir

Un sistema cromatográfico consta de dos fases Fase móvil(líquida o gaseosa): contiene los componentes a separar y fluye a través de la fase estacionaria Fase estacionaria(líquida o sólida): a través de la cual fluye la fase móvil y donde quedan momentáneamente retenidos los componentes de la muestra

Cromatografía: técnica separativa donde los componentes de una muestra se distribuyen entre dos fases (FM y FE), como consecuencia de su diferente afinidad hacia dichas fases. La separación se basa en las distintas velocidades de migración de los analitos, determinadas por el tiempo que permanecen en cada fase Definición

Clasificación FM FE Método Interacción L-L y L-FL partición L-L partición G-L adsorción adsorción L-S Inter. Iónico intercambio iónico reacción específica afinidad tamizado exclusión G-L y G-FL G-S líquida sólida resina i.i. gel poroso otras líquida sólida Líquida (cromatografía líquida) Gaseosa (cromatografía gaseosa) Fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos)

Clasificación De acuerdo a la disposición física de la FE Planar Columna papel capa delgada

FM FM FM Muestra FM B A B A Detector B Cromatografía en columna: elución A + B B A t4 t2 t0 t3 t1 Análisis cualitativo y cuantitativo

Cromatograma con picos no resueltos Mejora por aumento en la separación de bandas Mejora por disminución del ancho de bandas Objetivo de la cromatografía resolver los componentes de una muestra

t 1 t 2 t 3 B A A B Distribución de A y B dentro de la columna Concentración (CE) Distanciade migración (L) El ensanchamiento de cada banda se produce a una velocidad menor que su desplazamiento → se logran separaciones exitosas

Teorías del proceso cromatográfico La teoría del proceso cromatográfico debe explicar las variables que influyen en la velocidad de migración de los analitos y en el ensanchamiento de las bandas • Teoría de los platos: concepto de N y H (similitud con columna de destilación fraccionada). Explica la forma gaussiana de las bandas pero no su ensanchamiento durante el proceso cromatográfico. • Teoría cinética: La columna opera en situación de no-equilibrio. Nuevo concepto de N y H

t´ R t R t M Cromatograma SEÑAL DETECTOR TIEMPO compuesto no retenido por FE analito

CE mda/mte CM CM Isotermas de reparto y adsorción Cromatografía de adsorción Cromatografía líquida masa adsorbida/masa adsorbente

CE K = CM nE k = nM kB a = kA Constantes termodinámicas Mide la distribución del analito entre FE y FM Constante de reparto Factor de retención (factor de capacidad) Describe la velocidad de migración del analito en la columna Mide la selectividad de la columna de un analito respecto a otro Factor de separación (factor de selectividad)

tM/tR v/u = nM = = nM + nE 1 1 1 + k 1 + nE/nM v/u = Relación entre las constantes termodinámicas y el tiempo de retención velocidad lineal del soluto v = L/tR velocidad lineal de la FM u = L/tM velocidad relativa del analito dentro de la columna L/tR v/u = L/tM La velocidad relativa también se puede definir a partir de la fracción molar del soluto en la FM

v/u tM/tR v/u = = 1 1 1 + k 1 + k tR - tM tM = k = tM tR Relación entre las constantes termodinámicas y el tiempo de retención velocidad relativa Igualando los segundos miembros de ambas expresiones tR = tM (1 + k) tR = tM (1 + K VE/VM)

punto de inflexión t t señaldetector tiempo Ancho de banda W= 4t

Parámetros relacionados con el ancho de banda Eficiencia N y H N = L/H N = 16 (tR/W)2

s L t tR s t LtR = = s t LtR H t LtR = = recordando que: W = 4t t = W/4 2 2 2 2 2 2 HW L16tR LtR HW 2 2 16 = = 2 N N = 16 (tR / W)2 Demostración H = s2/L N = 16 (tR / W)2

resistencia a la transferencia de masa difusión en remolino Ecuaciones relacionadas con la eficiencia Relacionan la altura de plato teórico con los procesos dispersivos que ocurren dentro de la columna (A, B y C) y la velocidad de la fase móvil Ecuación de van Deemter H = A + B/m + Cm difusión longitudinal Otra ecuación H = A + B/m + CEm + CMm

3 3 2 2 1 1 diámetro medio de partículas constante de empaque Difusión en remolino A = 2  dp

factor de obstrucción coeficiente difusión del analito en FM Difusión longitudinal Dirección de FM B = 2  DM

Resistencia a la transferencia de masa Desde y hacia la FE: CE dirección de elución FM t1 FE FM t2 FE

2 qkd f C = E 2 + (1 k) D E 2t k d C = E 2 + (1 k) Resistencia a la transferencia de masa FE líquida FE sólida

2 2 f(d , m , d ) p c soporte soporte C = M D M Resistencia a la transferencia de masa Dentro de la FM: CM

H m Ecuación de van Deemter H = A + B/m + CEm + CMm CEm CMm H mínimo A B/m m óptimo

D 2 t r R = (W + W ) A B k N a-1 B R = 4 a 1+ k B Resolución

Optimización de la columna aumentar la separación entre bandas (DtR) disminuir el ancho de bandas Modificar variables que permiten ↓H y ↑N (ecuación tipo van Deemter) Modificar variables termodinámicas (K, k y a) modificando FM, FE y temperatura

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