Jong-Han Lee, Jin-Kyong Chun, Dong Soo Kim,Yongjung Park, Jong Rak Choi and Hyon-Suk Kim

1. Identification of Adenovirus, Influenza Virus, ParainfluenzaVirus, and Respiratory Syncytial Virus by Two Kinds of Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) and a Shell Vial Culture in Pediatric Patients with Viral Pneumonia Jong-Han Lee, Jin-Kyong Chun, Dong Soo Kim,Yongjung Park, Jong Rak Choi and Hyon-Suk Kim Seoul, Korea. Yonsei Med J 51(5):761-767, 2010

2. VİRAL PNÖMONİLİ ÇOCUKLARDA ADENOVİRÜS, İNFLUENZA VİRÜS, PARAİNFLUENZA VİRÜS VE RESPİRATUVAR SİNSİTYAL VİRÜSÜN İKİ FARKLI MULTİPLEKS PCR KİTİ VE SHELL VİAL KÜLTÜRÜYLE TANIMLANMASI Araş.Gör.Dr.Oya AKKAYA Prof.Dr.Bülent BAYSAL

3. GİRİŞ Akut viral kökenli solunum yolu hastalıkları çocuklarda morbiditeye yol açan en sık nedenlerdir Üst solunum yolunda sınırlanmalarına rağmen yine de alt solunum sistemi komplikasyonlarına yol açar Bu nedenle viral infeksiyonların erken ve hızlı tanısı, virüsün yayılımının engellenmesi için önemlidir

4. GİRİŞ Respiratuvar virüslerin PCR ile tespit edildiği birkaç çalışma vardır Bu çalışmalara göre toplumsal kaynaklı ve nasokomiyal solunum sistemi infeksiyonlarından en sık IFV, HPIV, AdV ve RSV izole edilmiştir IFV, enterovirüs ve AdV antiviral tedaviden faydalanabilecek virüslerdir Bu çalışmanın amacı, çocuklardaki şiddetli viral pnömoni sebeplerinin 2 farklı PCR kiti kullanılarak tespit edilmesidir

5. GEREÇ VE YÖNTEM ÖRNEK TOPLAMA: 2009 yılında Seul’de, 6 aylık bir periyodda, viral pnömoni semptomları olan 220 çocuk hasta pediyatri servisine yatırıldı Fizik muayene bulguları, akciğer röntgeni, kan testleri, sedimentasyon hızı ve CRP ile bakteriyel pnömoni ekarte edilip viral pnömoni tanısı kondu Bu hastalardan nasofarengeal sürüntü örneği alındı Bu örnekler çalışılıncaya kadar -75˚C’de saklandı

6. NÜKLEİK ASİT EKSTRAKSİYONU QIAamp viral RNA Mini Kit ( QIAGEN,Hilden, Germany ) ticari kiti kullanılarak 220 nükleik asit ekstraksiyonu yapıldı ve -70˚C’de donduruldu

7. Multipleks PCR Seeplex RV detection kiti Labopass RV detection kiti A setinde; AdV HMPV HCoV 229E/NL63 HPIV 1-2-3 B setinde; IFV A-B RSV A-B RhV HCoV OC43/HKU1 AdV HboV (bocavirüs) HCoV EnV HPIV 1-2-3 RhV RSV A-B IFV A-B

8. Seeplex RV detection kiti protokolü • 3 µL cDNA • 3 μL of 8-methoxypsoralen(MOP) solution • 4 μL of 5×RV Primer • 10μL of 2×master mix. Toplam 20 µL final solusyonu elde edilir

9. Seeplex RV detection kiti protokolü 94C’de 30 saniye 60C’de 1.5 dakika 35 siklus 72C’de 1.5 dakika Çoğaltılan ürünler etidyum bromürle boyanıp %2 agarose jelde yürütüldü Her virüsün markırı ve internal kontroller de yürütüldü

10. Labopass RV Detection kiti protokolü 2 farklı PCR kit protokolü kullanıldı: 95C’de 3 dakika 95C’de 1dakika 35 siklus 72C’de 1 dakika 72C’de 5 dakika bekleme ve uzama evresi

11. 42C’de 60 dakika 95C’de 3dakika 95C’de 1 dakika 35 siklus 55C’de 1dakika 72C’de 1 dakika 72C’de 5dakika final bekleme Bu protokol de ; HCoV, EnV, HPIV 1-2-3, RhV, RSV A-B içindir. Çoğaltılan ürünler etidyum bromürle boyanıp %2 agarose jelde yürütüldü

12. VİRÜS KÜLTÜRÜ Multipleks PCR kitleriyle pozitif sonuç veren ve AdV, IFV, HPIV ve RSV taşıyan örneklere R-Mix Ready Cells ( Diagnostic Hybrids,USA ) ticari kitinin prosedürlerine uygun olarak shell vial kültürü yapıldı

13. DİZİ ANALİZİ Kültür negatif, PCR pozitif olan 10 örnek için dizi analizi yapıldı Otomatize sekanslama analizörü olan Applied Biosystems, USA ile çalışıldı Sonuçlar Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) verileri kullanılarak verildi

14. BULGULAR

16. BULGULAR

17. BULGULAR Seeplex RV-12 kitinde 220 örnekte 116 pozitif bulundu(%52.7) Labopass RV kitinde ise 220 örnekte 102 pozitif bulundu (%46.4) Seeplex RV-12 kitinde koinfeksiyon oranı 15/220 (%6.8) Labopass RV kitinde ise 13/220 (%5.9) bulundu

18. BULGULAR • PCR’ın pozitif verdiği 103 örneğe shell vial kültürü yapıldı ve bunların 95 tanesinde üreme görüldü (Oran %90.3) • 3 örnekte ise ikişer virüs üredi • 95 örneğin • 15’i AdV • 6’sı IFV-A • 9’u IFV-B • 2’si PIV • 63’ü RSV çıktı Pozitif viral kültürün Seeplex RV-12 kitine oranı 99/103=%96 Pozitif viral kültürün Labopass kitine oranı 80/103=%78

19. BULGULAR 103 örneğin 50’si tutarlı sonuç verdi, her 3 yöntemde de aynı virüs bulundu 53 örnekte ise sonuçlar tutarsızdı, her 3 testte de farklı sonuçlar bulundu Bu 53 sonucun 17 tanesinde sonuç belirsizdi. Her testle farklı ve birden çok virüs bulundu

20. Multiplex PCR pozitif, viral kültür negatif

21. Multiplex PCR pozitif, viral kültür negatif olan 10 örnek için dizi analizi yapıldı Sonuçlar PCR ile %91-100 uyumlu çıktı Sadece 1 örnek PCR’da IFV-A iken, dizi analizinde rinovirüs çıktı

22. TARTIŞMA • Pediyatrik hastalarda, viral pnömoni tanısını erken koymak tedavi için önemlidir • Hem gereksiz antibiyotik kullanımından kaçınılmış olur hem de IFV, EnV, AdV gibi bazı viral infeksiyonlarda özel antiviral tedavilerden faydalanılmış olur • Bu çalışma da, kliniklere bu konuda faydalı olmak için 2 multipleks PCR kiti ve shell vial kültür yöntemi karşılaştırılmış ve hangisinin klinik olarak daha etkin olduğunu göstermek için yapılmış prospektif bir çalışmadır.

23. TARTIŞMA • Respiratuvar virüslerin tanısı için en yaygın kullanılan yöntemler viral kültür ve sonrasında yapılan immunfloresan boyama yöntemleridir • ELISA ise hızlıdır ama sensitivitesi daha azdır • Örneğin kalitesi, virüsün tipi, çalışan kişinin teknik hataları bu yöntemlerde önemlidir • Virüslerin teşhisinde virüs kültürü hala altın standarttır ama kültür yapımında, solunum yolu örneğinin transportu ve depolama koşulları önemlidir • üremeyi etkileyen faktörlerdendir

24. TARTIŞMA Choi ve ark.2006’da yaptığı bir çalışmada direkt antijen testini, viral kültürü ve multipleks PCR yöntemini karşılaştırmış ve AdV,IFV ve RSV için tespit oranını sırasıyla %28.4, 36.2, 44.8 bulmuştur Son zamanlarda en yaygın metot ise shell vial kültürü sonrası immunfloresan boyama olmuştur Ama bu metot kolay değildir ve rutin laboratuvarlar için uygun değildir

25. TARTIŞMA PCR yöntemleri iyi yöntemlerdir ama yanlış pozitiflik ve yanlış negatiflik dezavantajları vardır Kültürden daha hızlı ve daha sensitiftir Ayrıca HMPV gibi kültürde üretilmeleri zor olan bazı virüsler için de bu test bir avantajdır

26. TARTIŞMA Bu çalışmada 2 multipleks PCR kiti ve viral kültür arasındaki uyum oranı %49 bulundu ( 50/103) Viral kültürü yapılabilen sadece 4 virüs vardı: IFV, RSV, AdV, PIFV 2 multipleks PCR kiti arasında da uyumsuzluk vardı Seeplex RV kitinin pozitiflik oranı, Labopass PCR kitinden daha yüksek bulundu Buna rağmen , Labopass PCR kitinin HMPV tespit etme oranı Seeplex RV kitinden daha yüksek bulundu 2 PCR kiti arasındaki uyumsuzluk oranı %51 bulundu (53/103)

27. TARTIŞMA • Multipleks PCR kitleri arasındaki bu uyumsuzluk, kitlerin limitasyonlarından kaynaklanabilir • Bu sebeplerden biri, ekstraksiyon aşamasında PCR inhibitörlerinin temizlenememesi olabilir • Böylece yanlış negatif sonuç çıkmış olabilir • Bir başka sebep te, kullanılan primerin nükleotid varyasyonu nedeniyle virüsü tespit edememesi olabilir • Böyle bir durum varsa direkt antijen testi ve virüs kültürü PCR’ın yerine kullanılabilir

28. TARTIŞMA Seepleks RV’de koinfeksiyon oranı %7 (15/220) iken Labopass RV’de %6(13/220) bulundu Daha önceki çalışmalarda da, şiddetli infeksiyonlarda double-virüs infeksiyonu görülmüştür (Bu çalışmada infeksiyonun şiddeti araştırılmamıştır) Kültür negatif ve PCR pozitif 10 vaka direkt dizi analizi metoduyla değerlendirilmiş ve bu sonuçlar PCR ile karşılaştırılmıştır

29. Sonuç olarak Solunum yolu virüslerinin PCR ile tesbiti hızlı ve kolaydır Pozitiflik oranı virüs kültüründen yüksektir Bu nedenle klinik laboratuvarlarda solunum yolu infeksiyonlarında ilk seçenek olmalıdır Virüs kültürü ve dizi analizi ise sadece seçilen vakalarda yapılmalıdır