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Genes Associados a Estresses Bióticos e Abióticos em Plantas Cultivadas

Genes Associados a Estresses Bióticos e Abióticos em Plantas Cultivadas. Drª Ana Maria Benko-Iseppon Universidade Federal de Pernambuco Depto. De Genética, Lab. de Genética e Biotecnologia Vegetal. Onde tudo começou. Pós-Doutorado

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Genes Associados a Estresses Bióticos e Abióticos em Plantas Cultivadas

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  1. Genes Associados a Estresses Bióticos e Abióticos em Plantas Cultivadas Drª Ana Maria Benko-IsepponUniversidade Federal de PernambucoDepto. De Genética, Lab. de Genética e Biotecnologia Vegetal

  2. Onde tudo começou... Pós-Doutorado CAPESFrankfurt UniversityJohann Wolfgang Goethe UniversitätJan.-Dec. 1999

  3. Resistência a Doenças • Plantas & Animais • Importância para o melhoramento • Tipos de Resistência • Sistêmica (genes PR) • Conservados • Herança quantitativa • Específica (genes R) Benko-Iseppon AM UFPE, Depto. de Genética Genética e Biotecnologia Vegetal

  4. Principais Objetos de Estudo:1. Cicer Arietinum (grão-de-bico)2. Vigna unguiculata (feijão verde) • Culturas vegetais importantes para áreas de semi-árido • Nível diplóide: 2n=16 e 2n=22 • Auto-fecundação, gerações curtas, genoma relativamente pequeno (0,5 x 109) • Colheitas podem ser afetadas severamente (perdas de até 80%) pelo ataque de patógenos (fungos e vírus )

  5. Genoma Expresso (Transcriptoma): SUCEST Sugarcane EST Project Cana: Desafio & Oportunidade

  6. Genoma Expresso (Transcriptoma): FOREST Eucalyptus EST Genome Project Ana Objetivo: Identificar 15.000 genes através do seqüenciamento de cerca de 100.000 ESTs (20 labs.) obtidas a partir de bibliotecas de diferentes tecidos, incluindo plântulas, folhas, raízes, caule e madeira.

  7. Sequências similares conferem resistência a diversos patógenos como vírus, bactérias, fungos and nematóides. A maioria dos genes de resistência (genes R) pertence a famílias multigênicas. Genes R são altamente polimórficos e apresentam diversas especificidades de reconhecimento. Grupos vegetais diferentes apresentam genes R com domínios e padrões (motifs) com significativa conservação. Clusters de genes R parecem evoluir mais rapidamente do que outras regiões do genoma. A Arquitetura da Resistência

  8. Modelo da Interação Gene-a-Gene Patógeno Interação R & avr Produto avr Elicitores Gene R HR Morte Celular SA JA Etileno Genes PR Calosis Etileno Genes PR Fitoalexinas SA

  9. Interação Hospedeiro-Patógeno Avr & R Nematóide Fungo Bactéria After Bonas & Lahaye Curr. Opn. Microbiol. 2002 Transferabilidade & Mudança de Função Diversas localizações subcelulares

  10. Estrutura de Genes R A Ser/Thre Kinase B LRR-Ser/Thre-Kinase C NBS-LRR TIR NBS-LRR D E LRR Nucleot. Binding Site Toll-Interleukin Dom. Transmembrane Dom. Leucine Rich Repeats Ser.-Threon. Kinase Domínios conservados de genes R

  11. TIR (Toll Interleukin)-Like Resistance Gene Toll-like signalling in Drosophila Mammals Plants Semelhanças entre plantas e animais After Takken & Joosten Europ. J. Plant Pathol. 2000 LRR NBS TIR Ankyrin repeats Kinase Immunoglobulin domain Transcription Factor

  12. Arabidopsis thaliana • Estima-se que contenha aproximadamente 220 genes que codificam proteínas com o domínios NBS (em 21 clusters genômicos e 14 loci) • Seqüências TIR – ainda mais abundantes • Cerca de 600 seqüências não-TIR

  13. Estratégias de Amplificação Diferencial (RGAs = Resistance Gene Analogs)Isolamento de genes da classe NBS Kinase-1a and Transmembrane Region: 550 Bp H2N COOH Kinase-1a and Kinase-3a: 340 Bp Nucleotide-binding Site (NBS) (Kinase-1a, Kinase-2, and Kinase-3a Domain) PutativeTransmembrane Region Leucine-rich Repeats

  14. Obtenção e Identificação de RGAs Amplificação por PCR Clonagem dos Produtos de PCR Mapeamento de Restrição Seqüenciamento Automático Análise de ORF (Open Reading Frame) Anotação e Identificação do Gene

  15. Isolamento de RGAs (Resistance Gene Analogs): Domínio Kinase (1a) & Região Transmembrana Questões em Aberto sobre Genes R Macroevolução Evolução em plantas silvestres Comportamento em lenhosas e grupos primitivos

  16. Isolamento de RGAs (Resistance Gene Analogs): Domínio Kinase 1a & Kinase 3a

  17. Técnica de AFLP e SSAP Restriction of Genomic DNA Ligation of Adaptors Pre-Amplification with Adaptor Primer AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) SSAP (Sequence-specific Amplified Polymorphism) Selective Amplification Eco+2 GRP1 32 32 Mse+3 Mse0 P P GRP2 Eco+2 32 32 Mse+3 Mse0 P P

  18. Mapeamento Genético Cruzamento Interespecífico Cicer arietinum X C. reticulatum ICC4959 PI489777 (Resistant) (Susceptible)  F7 to F8 Recombinant Inbred Lines 131 Individuals Fusarium oxysporum fsp. ciceri Resistance Loci Linkage Group 2

  19. Marcadores Moleculares Usados • DAF - DNA Amplification Fingerprinting • RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA • STMS - Sequence Tagged Microsatellite Markers • AFLP - Amplification Fragment Length Polymorphism • SCAR - Sequence Characterized Amplified Regions • ISSR - Inter Simple Sequence Repeats • RGA - Resistance Gene Analogs • SSAP - Sequence-Specific Amplified Polymorphism

  20. Mapa Genético Gerado 8 grandes + 8 pequenos grupos de ligação • Características: • 412 marcadores em 8 grupos de ligação • Tamanho total 2.330 cM • Distância Média entre os marcadores: 6,7 cM • Relação Média Kb / cM = 322 (genoma = 750 Mb) • “Ilhas” ou “clusters” com acúmulo de marcadores

  21. Mapeamento Fino Análise Segregante de Bulks “Caçando um Gene Específico” Respectivamente 12 Linhagens: Bulk Resistente: R14, R18, R22, R29, R53, R56, R72, R74, R87, R88, R94, R96 Bulk Suscetível: S11, S25, S32, S37, S40, S49, S55, S61, S63, S64, S65, S77 Primeira Seleção de Primers: 432 Primers Testados em 2 Semanas  174 Primers Polimórficos  Análise nos parentais e em sete indivíduos R e S

  22. Última Seleção de Marcadores R1 – R7 S1 – S7 PR PS A PR= Parental Resistente PS= Parental suscetível R= indivíduo resistente S= indivíduo suscetível 32 Primers testados 24 Ligados (no LG 2) 18 seqüenciados 500 kb  B 500 kb 

  23. Mapeamento Fino do Gene Foc 4 Região de resistência ao redor dos genes Foc 4 e Foc 5

  24. Identidade de alguns Marcadores Seqüenciados • OP-P08-1 840 bp = N-Polyacetil-Benzoyltransferase (proteína reguladora da síntese de fitoalexinas). • OP-M20-1/3  1103 bp = Disease resistance N (Nicotiana)-like protein from Arabidopsis thaliana(E-value 0.0) • OP-P15-3/1 577 bp = Hypersensitivity response related gene 201 isolog from Arabidopsis thaliana(2e-28) • P-U17-1  1014 bp = Pathogenic related thaumatin-like protein precursor from Prunus avium(1e-10) • OP-M20-1/2  1045 bp = MUTS2 DNA mismatch repair protein from Arabidopsis thaliana(7e-09) • OP-P06-1 784 bp = Retrotransposon-like gag-protein sequence from Nicotiana tabacum putatively linked to black root rot resistance in tobacco(8e-04)

  25. Sintenia e Colinearidade

  26. Projeto Genoma da Cana A Estratégia Planejado: 100.000 ESTs (reads) 30.000 clusters 25 Bibliotecas 25 grupos de anotação Realizado: 291.904 ESTs(reads) 43.141 clusters 26 Bibliotecas 49 grupos de anotação

  27. Hierarquia de Seleção, Anotação e Análise de ESTs Banco de Dados do SUCEST BLASTx, tBLASTn, etc. GenBank Busca por homologia e por palavras-chave Seqüências Completas & Melhores Alinhamentos e-20 ou menos Tradução/CodonUsage Conteúdo AT-GC Clone Manager Busca Domínios CD-Search/RPS-BLAST Análise de ORFs ORF-Finder Avaliação de Qualidade e Fenotipagem Alinhamentos Múltiplos Clustal W Localização Subcelular Programa TargetP Análise de Expressão “Clusterização Hierárquica” Vias Metabólicas Análises Filogenéticas e Fenéticas

  28. Genes R em Cana-de-Açúcar

  29. Onde os Genes de Resistência são Expressos na Cana? Meristema Apical (2) AM 11.1% Raiz (3 ) Raiz-Caule (3) RT 7.1% RZ 13.1% Brotos foliares (8 ) LR 6.7% AD 6.5 % Gluconacetobacter ST 6.1% Flores (8 ) FL 27.1% Internós (2 ) Sementes Germinantes (2 ) SD 5.5% NR 0.2% LB 5.3% Gema Lateral (2) SB 4.6% HR 2.6% LV 2.2% CL 1.8% Calo estresse temp/luz (1) Colmo (1) Herbaspirilum Folhas adultas (1 )

  30. Alinhamento Múltiplo com Clustal X Gene CHS1 Seqüências de aminoácidos

  31. Geração de Dendrogramas Diferentes genes Alguns com poucas seqüências completas nos bancos de dados Seqüências Filogenetica-mente Informativas Níveis macro e microevolutivo Plantas Leveduras Fungos Animais

  32. Geração de Dendrogramas Pressão de seleção do patógeno Evolução de caráter adaptativo Variações alélicas até análogos na própria cana

  33. Leaf Roll I II Root Apical Meristem III IV Root to shoot V Flowers

  34. Genes R Expressos em Eucalipto FOREST 210clusters GMB, 2005 (Vol. Especial Genoma Eucalipto)

  35. Salinidade & Seca Solo Salino Espaço Intracelular Pelo radicular Direção da Água Direção da Água Quais genes definem a resistência à salinidade em plantas? Concentração Relativa de Sais

  36. Resistência à Salinidade Herança  Multifatorial, Poligênica... Evolução Genes importantes diferem entre entidades taxonômicas próximas Convergência baseada em caracteres adaptativos super expressão do gene DREB1A(Dehydration Response Element-Binding protein 1A) AtNHX1 Grupo Trocadores Na+/H+ Vacuolização Tolerância definida por 1 gene?

  37. Seca Frio 53 277 7.000 genes analisados Pico de ativação 2 a 2,5 h após adição do elicitor Expressao aumentada 5x ou mais 8 128 21 22 2 119 51 Taji T, Seki M, Satou M, Sakurai T, Kobayashi M, Ishiyama K, Narusaka Y, Narusaka M, Zhu JK, Shinozaki K (2004) Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray. Plant Physiol 135: 1697–1709. Seki, M. et al. (2002). Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and high salinity stresses using a full length cDNA microarray. The Plant Journal. 31: 279-292 Salinidade 194

  38. Salinidade e Seca – Principais Genes

  39. Trocador H+/Ca2+ Plantas Superiores Fungos

  40. MIP (Proteínas Intrínsecas de Membrana) em Eucalyptus Atuam como facilitadoras do transporte passivo de pequenos solutos através dos sistemas de membranas. Proteínas intrínsecas de membrana plasmática, do tonoplasto, tipo nodulina-26 e pequenas proteínas básicas de membrana Motivos NPA e domínios transmembrana variáveis (4 a 8 repetições).

  41. MIPDifferential Display Padrão de expressão das 36 seqüências analisadas: Alta expressão de EUC-04 em ST-2 e EUC-07 em RT-06.Clusters EUC-28, EUC-33 e EUC-35 se expressam respectiva e exclusivamente nas bibliotecas RT6, LV2 e SL5 (tecidos são raízes resistente a geada, folhas deficientes em fósforo e boro e plântulas estioladas).

  42. Proteínas encontradas nas membranas celulares desde procariotos até eucariotos, aumentando a permeabilidade para água e/ou glicerol. Aquaporinas em Cana-de-Açúcar PIP Análise do padrão de expressão de aquaporinas: 47 clusters e 887 reads) de cana-de-açúcar. Abreviações: RT= Raiz; FL= Flor. TIP NIP Peso molecular e ponto isoelétrico para os representantes das diferentes subfamílias de aquaporinas em A. thaliana, Z. mays, O. sativa e S. officinarum. Subfamília SIP = área delimitada. Programa JvirGel. SIP

  43. Publicações • SILVA, A. B., NOGUEIRA, A.C.B., SILVA, R.R.M., SILVA, L.C.B., SOARES-CAVALCANTI, N.M., BENKO-ISEPPON, A.M. (2005). In silico survey of resistance (R) genes in Eucalyptus transcriptome. Genetics and Molecular Biology 28: 562-574. • RAKSHIT, S., WINTER, P., BENKO-ISEPPON, A.M.; MUEHLBAUER, F.J., KAHL, G. (2003). DAF marker tightly linked to a major locus for Aschochyta blight resistance in chickpea (Cicer arietinum L.). Euphytica 132: 23-30. • BENKO-ISEPPON, A. M.; WINTER, P., HÜTTEL, B., MUEHLBAUER, F. J., KAHL, G. (2003). Molecular markers closely linked to fusarium resistance genes in chickpea show significant alignments to pathogenesis-related genes located on Arabidopsis chromosomes 5 and 1. Theoretical and Applied Genetics 107: 379-386. • WINTER, P., BENKO-ISEPPON, A. M.; HÜTTEL, B., PFAFF, T., KAHL, G., MUEHLBAUER, F. J. (2000). A linkage map of the chickpea (Cicer arietinum L.) genome based on recombinant inbred lines from a C. arietinum x C. reticulatum cross: localization of resistance genes for Fusarium wilt races 4 and 5. Theoretical and Applied Genetics 101: 1155-1163. • WINTER, P., STAGGINUS, C., HÜTTEL, B., PFAFF, T., BENKO-ISEPPON, A. M.; RAKSHIT, S., KAHL, G. (2004). Architecture and Maps of the Chickpea Genome: A Basis for Understanding Plant-Rhizobium Interaction. In:Symbiotic Nitrogen Fixation: Prospects for Enhanced Application in Tropical Agriculture.1st Ed., New Hamshire : Science Publishers USA, 1: 286-293. • BENKO-ISEPPON, A.M.; SOARES-CAVALCANTI, N.M., NOGUEIRA, A.C.W., SILVA, L.C.B., SILVA, R.R.M., ALMEIDA, P.M.L., BRUNELLI, K.R., KIDO, L.M.H., KIDO, E.A. (2005). Genes associados a estresses bióticos e abióticos em feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] e outras angiospermas. In: Estresses Ambientais: danos e/ou benefícios para as plantas. 1ª Ed. Recife: Sociedade Brasileira de Fisiologia Vegetal, v.1: 350-359.

  44. Agradecimentos • CAPES/MEC • FACEPE • CNPq • FAPESP & SUCEST & FOREST • Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt, Germany (Günter Kahl / Peter Winter) • Volkswagen Foundation • RENORBIO/BNB • Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE.

  45. Obrigada!

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