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IDENTIFICAZIONE: l’approccio tradizionale

IDENTIFICAZIONE: l’approccio tradizionale. Identificazione convenzionale. Test biochimici Test colturali. Test biochimici. Accumulo di niacina Riduzione dei nitrati Catalasi a 68°C semiquantitativa Idrolisi del Tween 80 Ureasi Riduzione del tellurito Arilsolfatasi β-glucosidasi.

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IDENTIFICAZIONE: l’approccio tradizionale

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Presentation Transcript

  1. IDENTIFICAZIONE:l’approccio tradizionale

  2. Identificazione convenzionale • Test biochimici • Test colturali

  3. Test biochimici • Accumulo di niacina • Riduzione dei nitrati • Catalasi • a 68°C • semiquantitativa • Idrolisi del Tween 80 • Ureasi • Riduzione del tellurito • Arilsolfatasi • β-glucosidasi

  4. Niacina • Prodotto del metabolismo micobatterico accumulato nel terreno • requisiti della coltura • l’estrazione • la rivelazione • 24 ore • Distingue il M. tuberculosis dalle altre specie • Irregolarmente positiva nel M. simiae • Raramente positiva in altri micobatteri

  5. Nitrati • Svariate specie micobatteriche sono in grado di ridurre i nitrati a nitriti • 4 ore

  6. Catalasi a 68°C • Praticamente tutti i micobatteri producono catalasi • In quasi tutte le specie, ad eccezione di quelle del M.tuberculosis complex la catalasi è termoresistente • incubazione a 68°C per 20 min • rivelazione con H2O2 • 20 min

  7. Catalasi semiquantitativa • I diversi tipi di catalasi prodotti dalle varie specie micobatteriche differiscono anche quantitativamente • Il test permette di differenziare i ceppi che, in seguito all’aggiunta di H2O2, producono una colonna di bollicine superiore, o inferiore, a 45 mm • 14 giorni

  8. Idrolisi del Tween 80 • Alcuni micobatteri possiedono una esterasi, grazie ad essa sono in grado di idrolizzare il Tween 80 • Utilizzando Tween legato a rosso neutro, l’idrolisi è evidenziata dal viraggio al rosso • 10 giorni

  9. Ureasi • Alcuni micobatteri sono in grado di idrolizzare l’urea • L’avvenuta idrolisi è indicata dal viraggio di un idoneo indicatore • 3 giorni

  10. Riduzione del tellurito • La capacità di ridurre il tellurito di potassio a tellurio metallico si evidenzia dalla formazione di un precipitato nero • 10 giorni

  11. Arilsolfatasi • I micobatteri provvisti di arilsolfatasi sono in grado di idrolizzare la fenolftaleina tripotassica a fenolftaleina • La fenolftaleina, in ambiente alcalino, sviluppa un colore rosso • 3 giorni

  12. β-glucosidasi • I micobatteri che possiedono la β‑glucosidasi sono in grado di idrolizzare i β‑glucosidi liberando glucosio • Usando come substrato il p‑nitrofenil‑D‑glucoside si ha liberazione di p‑nitrofenolo che è giallo • 3 ore

  13. Test colturali • Velocità di crescita • Temperature di crescita • Pigmento • Morfologia delle colonie • Test di inibizione selettiva

  14. Velocità di crescita • I micobatteri a crescita rapida formano colonie visibili ad occhio nudo in meno di una settimana • I micobatteri a crescita lenta possono richiedere anche 6 settimane • Il tempo richiesto per la crescita nella coltura primaria non è indicativo • Il tempo richiesto per la crescita in coltura liquida non è indicativo • Il test deve essere eseguito utilizzando un inoculo diluito

  15. Temperature di crescita • Il range di temperatura che permettono lo sviluppo delle varie specie batteriche è ampio • Oltre all’incubazione a 37°C è necessario provare almeno altre due temperature, 25-30°C e 42‑45°C

  16. Pigmento • I micobatteri si distinguono in: • non cromogeni • scotocromogeni • fotocromogeni

  17. Morfologia delle colonie • Aspetto macroscopico • Aspetto microscopico (100x)

  18. Test di inibizione selettiva • L’aggiunta al terreno di particolari sostanze permette di distinguere le specie che ne tollerano la presenza, che crescono, da quelle che ne risultano inibite • TCH • NaCl • Tiacetazone • Idrossilamina • (MacConkey) • NAP

  19. Identificazione • Confronto dei risultati dei test con i dati presenti in letteratura (tabelle)

  20. Identificazione

  21. Impiego attuale • Identificazione del M. tuberculosis • Niacina + nitrati • Identificazione dei MOTT • Ampio pannello di test • Supporto ad altri approcci identificativi • Test mirati • Velocità di crescita • Pigmento • Temperature di crescita

  22. Conclusioni • Non esistono kit commerciali • I tempi sono estremamente lunghi • Non tutti i test sono perfettamente riproducibili • L’affidabilità delle identificazioni è buona solo per le specie più comuni • Non permettono di riconoscere i micobatteri rari o “nuovi” • Alcuni test possono essere utilizzati per dirimere ambiguità emergenti da altri sistemi di identificazione • Permettono di differenziare le specie all’interno del M. tuberculosis complex

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