RNA 干扰 （ RNA interference ， RNAi ）

1. 分子生物学实验技术 RNA干扰（RNA interference，RNAi） 重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室 刘先俊

2. 实验目的 1.掌握RNA干扰的基本原理； 2.了解研究RNA干扰的技术路线及应用。

3. 一、RNAi概述 • RNAi：短双链RNA（dsRNA）诱导靶基因mRNA特异性降解，或阻止mRNA翻译，产生基因沉默（gene silence)的现象。因此，又称为knockdown。

4. 二、RNAi作用机制 • 当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶（Dicer）识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。 • 识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 • 核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。

5. RNAi 的基本过程： • siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能量； • RISC（RNA-induced silencing complex）形成：与RNAi辅助蛋白结合形成RISC，消耗ATP能量； • RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的复合体转变成活性形式； • 阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下，RISC识别并切割互补的靶RNA，无需或消耗少量ATP。

7. 三、RNAi研究的一般技术路线

8. 1、siRNA 的设计

9. 何为siRNAs • siRNA （small interfering RNAs，siRNAs）即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子。

10. 一般设计原则 （1）从mRNA 的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST （3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计4-5个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

11. 负对照 • 一个完整的siRNA实验应该有负对照。 • 作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。 • 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。

12. 2、制备siRNAs的方法

13. 1.化学合成； 2.体外转录； 3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA； 4. siRNA表达载体 5. siRNA表达框架

14. 制备siRNA5种不同方法的比较

15. 制备siRNA5种不同方法的比较（续）

16. 4. 转染细胞 5. RNAi的效果分析

17. RNAi 的应用 • 基因功能分析 • 胚胎发育与干细胞基因调控研究 • 细胞增殖与分化基因调控研究 • 细胞生长与转移基因调控 • 多基因疾病发病机制研究 • 表观遗传学分析（RNAi可诱导基因甲基化） • 信号通路新分子的筛选与鉴定 • 寻找新的药物靶标、基因治疗 • 药物作用机制探讨