Enzymologia-5

1. Enzymologia-5 Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych

2. Najważniejsze metody badania mechanizmów reakcji • Określanie struktury enzymu • Modyfikacja chemiczna enzymu • Ukierunkowana mutageneza genu kodującego enzym • Detekcja intermediatów reakcji enzymatycznej • Badanie kinetyki reakcji enzymatycznej

3. Zastosowanie badań strukturalnych do określania mechanizmów reakcji Metody: niskotemperaturowa rentgenografia strukturalna, NMR Szczególne znaczenie – określanie struktury kompleksu enzymu z analogiem substratu lub analogiem stanu przejściowego Struktura kompleksu hydroksymetylotransferazy serynowej z adduktem substratu z koenzymem oraz analogiem drugiego substratu

4. Reakcja katalizowana przez karbamoilotransferazę asparaginianową Stan przejściowy Analog stanu przejściowego

5. Struktura kompleksu karbamoilotransferazy asparaginianowej z PALA

6. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU • Działanie na enzym związkiem chemicznym powodującym inaktywację • Dwa podejścia: • odczynniki specyficzne wobec grup funkcyjnych określonych reszt • aminokwasowych; • analogi substratu lub stanu przejściowego reakcji enzymatycznej • zawierające reaktywne ugrupowania chemiczne (ang. affinity labeling) • Pojęcie reszty istotnej dla aktywności enzymu • modyfikacja chemiczna reszty powoduje całkowitą utratę aktywności przez • enzym; • stechiometria inaktywacji 1 : 1; • substrat lub inhibitor kompetytywny chronią enzym przed inaktywacją

7. Kinetyka inaktywacji enzymu

10. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU • Odczynniki ukierunkowane na reszty cysteinylowe • A. -halogenooctany i -halogenoacetamidy • Warunki: pH  7; labilne w roztworach wodnych; reaktywność I>Br>>Cl; • dla jodopochodnych rekcję należy prowadzić w ciemności • B. N-podstawione imidy kwasu maleinowego • Warunki: pH  7; możliwość śledzenia zaniku absorpcji przy  = 302 nm; • dla NEM  = 620 M-1cm-1

11. C. Kwas 2-nitro-5-tiocyjanobenzoesowy Warunki: pH = 8.0; niezbyt duże nadmiary molowe odczynnika (1,5  do 2 ); dla wytworzonej S-cyjanopochodnej max = 330 nm,  = 7500M-1cm-1 D. Odczynnik Ellmana – kwas 5,5’-ditiobis(5-nitrobenzoesowy) Używany do ilościowego oznaczania grup tiolowych.

12. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynnik ukierunkowany na reszty reszty serylowe  Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)

13. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty lizylowe A. Imidoestry Warunki: długie czasy reakcji B. Kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy Warunki: Barwny produkt podstawienia; max = 420 nm,  = 20 000 M-1cm-1

14. C. Fosforan pirydoksalu Warunki: najwyższa selektywność; wytworzenie trwałego wiązania dopiero w wyniku redukcji zasady Schiffa; reakcję należy prowadzić w ciemności; cyjanoborowodorek preferowany wobec borowodorku bo można prowadzić reakcję w roztworze wodnym (uwaga: tylko w pH >7!)

15. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU • Odczynniki ukierunkowane na reszty histydylowe • A.Dietylopirowęglan • Warunki: odczynnik specyficzny dla His w zakresie pH4,5 – 7; produkt modyfikacji • absorbuje w UV - max = 240 nm,  = 3200 M-1cm-1; odczynnik nietrwały w roztworach • wodnych; w pH 7 czas połowicznego rozpadu = 10 min; im niższe pH tym większa • trwałość odczynnika

16. B. Róż Bengalski – odczynnik fotoutleniający Warunki: ograniczona specyficzność (możliwe utlenienie Cys, Met i Trp); reakcję prowadzi się w temp 0 - 4C naświetlając promieniowaniem w zakresie VIS

17. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty tyrozylowe A. N-acetyloimidazol Warunki: duże nadmiary odczynnika. Unikać buforu Tris. Reakcja dość wolna  B. Tetranitrometan Warunki: można śledzić postęp reakcji przy  = 350 nm,  = 14.400 M-1cm-1 (anion trinitrokarboniowy). Może zachodzić utlenienie cysteiny.

18. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty tryptofanylowe A. N-bromoimid kwasu bursztynowego Warunki: reakcja w buforze octanowym; gwałtowny przebieg; ograniczona specyficzność (ulegają też Tyr, Cys. Met) B. Bromek 2-hydroksy-5-nitrobenzylu (BHNB) C. Sól dimetylosulfoniowa BHNB odczynnik rozpuszczalny w wodzie Warunki: duże nadmiary odczynnika (nawet 100 ); reakcja w ciemności; odczynnik słabo rozpuszczalny w wodzie

19. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty Glu i Asp A. Rozpuszczalne w wodzie pochodne karbodiimidu Schemat przebiegu reakcji Warunki: reakcja specyficzna w pH 4 – 6; duże nadmiary odczynnika; jako aminę stosuje się najczęściej ester metylowy glicyny; w kwaśnym pH konkurencyjna reakcja hydrolizy jest bardzo wolna.

20. MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Izomeraza fosfotriozowa

21. Technologia ukierunkowanej mutagenezy metodą wydłużania primera

22. Zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy do identyfikacji reszt • istotnych dla aktywności enzymu • Enzym syntaza GlcN-6-P Struktura przestrzenna enzymu Analiza porównawcza sekwencji syntazy GlcN-6-P z różnych źródeł podstawą selekcji reszt do ukierunkowanej mutagenezy

23. Zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy do identyfikacji reszt • istotnych dla aktywności enzymu • Enzym syntaza GlcN-6-P Aktywność glutaminazowa: L-Gln + H2O  L-Glu + NH3 Aktywność izomerazowa: Fru-6-P  Glu-6-P Aktywność syntazowa: L-Gln + Fru-6-P  L-Glu + GlcN-6-P

24. Detekcja intermediatów Niektóre produkty przejściowe reakcji enzymatycznej są stosunkowo stabilne (głębokie minimum energetyczne) – istnieje możliwość detekcji metodami spektroskopowymi: spektrofluorymetria, NMR niskotemperaturowy; Początkowe etapy reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę Wyłapywanie intermediatów za pomocą reakcji chemicznej Redukcja produktu przejściowego w postaci zasady Schiffa prowadzi do powstania stabilnego adduktu

25. Informacje dotyczące mechanizmu działania enzymu, które można uzyskać z pomiarów kinetycznych

26. Zależność aktywności enzymu od zmian struktury substratu Papaina – proteinaza cysteinylowa Badania specyficzności substratowej papainy wobec syntetycznych oligopeptydów wykazały istnienie w centrum wiążącym substrat obecność 7 „subcentrów” S2 – specyficzne wobec L-Phe S1’ – stereospecyficzne dla L-aminokwasów, z preferencją dla L-Leu i L-Trp Tripeptyd Ala-Phe-Arg jest inhibitorem kompetytywnym enzymu Czy tetrapeptyd Ala-Phe-Arg-Leu jest także inhibitorem?

27. Zależność zmian aktywności enzymu od pH Analiza kształtu zależności v = f(pH) daje możliwość wyznaczenia pKa reszt ulegających jonizacji, które są istotne dla aktywności enzymu Analiza zależności pKa reszt jonizujących od polarności rozpuszczalnika pozwala na określenie stanu jonizacji reszty -COO- + H+ -CO2H W tym przypadku obniżenie polarności rozpuszczalnika jest niekorzystne dla dysocjacji. pKa rośnie przy obniżaniu polarności. -ImH+ -Im + H+ A jak w tym przypadku?

28. Kinetyka stanów nieustalonych Schemat aparatury do pomiarów kinetycznych metodą stopped flow

29. Kinetyka stanów nieustalonych • Warunki pomiaru: • stężenia enzymu i substratu na porównywalnym poziomie • techniki pomiarowe umożliwiające określanie niewielkich zmian stężenia w krótkim czasie (ang. stopped flow) Przykład: reakcja wiązania NADH przez dehydrogenazę mleczanową. Pomiar zmian stężenia NADH metodą spektrofluorymetryczną przez 16 ms; Stężenia początkowe enzymu i NADH identyczne – 8 M. k1 E + NADH [E:NADH] k-1 Reakcja II rzędu, ale ponieważ [E] = [S], to połowiczny czas reakcji można wyrazić wzorem:  = 1/k [S]. Z eksperymentu otrzymano  = 2 ms k = 1/ [S] = 6,7  107 M-1 s-1 Ponieważ k1>> k-1, to k = k1

30. Kinetyka hydrolizy octanu p-nitrofenylu przez chymotrypsynę Faza I – tworzenie produktu przejściowego - acyloenzymu Faza II – hydroliza produktu przejściowego