MÉTODOS RÁPIDOS DE ANÁLISE DE MATERIAL BIOLÓGICO: BAX E RIBOPRINTER

1. CURSO AVALIAÇÃO DA CONFORMIDADE DE MATERIAL BIOLÓGICO MÉTODOS RÁPIDOS DE ANÁLISE DE MATERIAL BIOLÓGICO: BAX E RIBOPRINTER LIDIANE BOTELHO lidiane@ital.org.br

2.  IMPORTÂNCIA DAS ANÁLISES (QUAIS, QUANTOS, CONDIÇÕES HIGIÊNICAS, RISCOS, VIDA ÚTIL);  DETERMINAÇÃO DO AGENTE ETIOLÓGICO (TOXINFECÇÕES) PADRÕES E ESPECIFICAÇÕES ADEQUADOS  ANÁLISES PODEM INVESTIGAR - PRESENÇA OU AUSÊNCIA, QUANTIFICAR, IDENTIFICAR E CARACTERIZAR AS DIFERENTES ESPÉCIES.

3. MÉTODOS CLÁSSICOS (CONVENCIONAIS) X MÉTODOS RÁPIDOS

4. MÉTODOS CLÁSSICOS (CONVENCIONAIS) • Desenvolvidos a muito tempo; • Empregados como métodos oficiais; • Métodos estão descritos em publicações consideradas de referência, internacionalmente aceitas. MÉTODOS RÁPIDOS • Abreviar o tempo necessário para a obtenção dos resultados; • Melhorar a produtividade laboratorial; • Simplificação do trabalho; • Redução de custos; • Maior sensibilidade e especificidade que os métodos convencionais.

5. PRINCIPAIS MÉTODOS CONVENCIONAIS E SUAS DESVANTAGENS: • CONTAGEM POR PLAQUEAMENTO: • É A MAIS UTILIZADA PORÉM É MUITO TRABALHOSA QUANDO MUITAS DILUIÇÕES PRECISAM SER ANALISADAS OU QUANDO O NÚMERO DE AMOSTRAS É GRANDE. LEITURA TAMBÉM PODE SER DIFÍCIL, CANSATIVA E IMPRECISA. • - NÚMERO MAIS PROVÁVEL: • ESTIMAR A CONTAGEM DE ALGUNS MICRORGANISMOS COLIFORMES). MÉTODO BASTANTE ANTIGO MAS OS RESULTADOS SÃO IMPRECISOS, UMA VEZ QUE PERMITE APENAS UMA ESTIMATIVA DO NÚMERO PRESENTE.

6. OUTRAS DESVANTAGENS NOS MÉTODOS CONVENCIONAIS SÃO: - SEMEADURAS EM MEIOS DE CULTURA PARA O ISOLAMENTO DE COLÔNIAS E TESTES COMPLEMENTARES PARA A IDENTIFICAÇÃO; Pré-enriquecimento em caldo não seletivo (18 horas); Enriquecimento em caldo seletivo (18 - 24 horas); Plaqueamento seletivo diferencial (18h - 37ºC) Confirmação

7. -ALGUNS MICRORGANISMOS SE APRESENTAM INJURIADOS (ETAPA DE PRÉ-ENRIQUECIMENTO); -ENRIQUECIMENTO SELETIVO (ADICIONAL); - MÉTODOS BASEADOS NO COMPORTAMENTO BIOQUÍMICO FRENTE A DIFERENTES SUBSTRATOS (REAÇÕES BIOQUÍMICAS); Rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo) com ou sem produção de H2S (escurecimento do ágar). Fermentação da lactose

8. NOS ÚLTIMOS ANOS VÁRIAS TÉCNICAS TÊM SIDO PROPOSTAS E AVALIADAS; • SIMPLIFICAM E MELHORAM A PRECISÃO DOS RESULTADOS DE IDENTIFICAÇÃO; • NOVOS MÉTODOS - CLASSIFICADOS EM: • TÉCNICAS BIOQUÍMICAS MINIATURIZADAS • TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS • TÉCNICAS GENÉTICAS

9. BAX

11. BAX SYSTEM • DETECÇÃO DE PATÓGENOS; • Salmonella sp • Listeria sp • Listeria monocytogenes • E. coli O157:H7; • Enterobacter sakazakii

12. CARACTERÍSTICAS • ANÁLISE DE PRESENÇA OU AUSÊNCIA; • UTILIZA A TÉCNICA PCR • (POLYMERASE CHAIN REACTION); • DETECÇÃO DO DNA BACTERIANO; • TOTALMENTE AUTOMATIZADO • (AMPLIFICAÇÃO, DETECÇÃO E INTERPRETAÇÃO); • ALTO VOLUME DE ANÁLISE (96 AMOSTRAS SIMULTÂNEAS PARA O TARGET DE ESCOLHA); • MUITO FÁCIL USO; • -OS REAGENTES ESTÃO EM TABLETES; • -3 ½ PARA O ENRIQUECIMENTO; • -DETECÇÃO: 1UFC/25g DO ALIMENTO; • -ALTA ESPECIFICIDADE.

14. (POLYMERASE CHAIN REACTION)

15. ETAPAS EXTERNAS 1 – PREPARAÇÃO DO DNA

16. ASPECTOS QUE DEVEM SER OBSERVADOS: • - 1º • Salmonella: • Protocolo padrão (TSB, Água Peptonada, Caldo Lactosado) - interferência química • Regrow: BHI • E. coli: • Protocolo padrão • Exceção: Carnes – (não há a necessidade de fazer o regrow) • -L. monocytogenesou sp: • 1-Caldo LEB (24hs) • 2-Mops Bleb (24hs) • - 2º (Lise celular) – Gram +

17. ETAPAS INTERNAS 2 – AMPLIFICAÇÃO

18. 3 – DETECÇÃO

21. RIBOPRINTER

23. CARACTERÍSTICAS • É UM LABORATÓRIO COMPLETO DE TAXONOMIA BACTERIANA (IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO); • RNA BACTERIANO; • -FINGERPRINTING; • COMPLETAMENTE AUTOMATIZADO; • CAPACIDADE SIMULTÂNEA DE ANÁLISE PARA 8 BACTÉRIAS; • COMPARTILHAMENTO DE DADOS; • 8 HORAS PARA OBTENÇÃO DOS RESULTADOS; • É O ÚNICO EQUIPAMENTO DO GÊNERO QUE IDENTIFICA E CARACTERIZA; • O KIT VEM COM TODOS OS REAGENTES NECESSÁRIOS PARA REALIZAR 42 ANÁLISES;

24. RIBOTIPAGEM

25. -Grimont & Grimont 1986; • Baseia-se no fato de que os genes associados com o RNAr estão distribuídos ao longo de todo o cromossomo bacteriano, podendo produzir diferentes padrões de bandeamento (polimorfismo) quando o cromossomo é clivado com enzimas de restrição e hibridização com uma sonda de RNAr. • Variação de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorfism) onde a sonda utilizada para detectar o polimorfismo é específica para RNAr.

26. A seqüência de RNAr pode ser selecionada de modo a se utilizar uma sonda específica para aquela espécie bacteriana da análise. Entretanto, algumas seqüências de RNAr estão conservadas em diferentes gêneros bacterianos. Assim, é possível, por ex. realizar a ribotipagem de amostras de S. aureus com uma sonda de RNAr isolada de E. coli. • -Princípio avaliar o polimorfismo do DNA na região onde está localizado o operon rrn; Composto pelos genes 16S e 23S, que codificam o rRNA das bactérias;

27. -Estes genes são altamente conservados nas espécies bacterianas o que permite o estudo de diferenciação das espécies bacterianas; -rRNA 80% / 2.000 cópias / vida média até 100h; --No DNA os genes responsáveis pela transcrição dessas moléculas são organizados em uma única unidade de transcrição;

28. Ordem dos genes é: promotor, 16S, tRNA, 23S e 5S, e separando cada gene, há seqüências de nucleotídeos chamadas de regiões espaçadoras ITS (Internal transcribed spacer) – variam muito (valor caracterização intragenérica)

30. PASSOS DA TÉCNICA DE RIBOTIPAGEM NO RIBOPRINTER - ETAPA EXTERNA

31. 1 – ISOLAMENTO DO DNA CROMOSSÔMICO; HOMOGENIZAR 30L DUAS DILUIÇÕES 40L TAMPÃO

32. INATIVAR AS NUCLEASES E LISE • CICLOS DE AQUECIMENTO E RESFRIAMENTO -5 L REAGENTES DE LISE A E B – RUPTURA DA MEMBRANA DAS CÉLULAS -INTRODUZIR AS AMOSTRAS NO RIBOPRINTER 30L COLOCAR NO CARREGADOR DE AMOSTRAS

34. ETAPA INTERNA

35. 2 – DIGESTÃO COM ENZIMA (S) DE RESTRIÇÃO; • 3 – PFGE (PULSED FIELD GEL ELETROPHORESIS); • Separação: corrida em gel de eletroforese e separação dos fragmentos pelo peso molecular • 4 – SOUTHERN BLOT HIBRIDIZATION • Transferência: dos fragmentos imobilizados na membrana de nitrocelulose

36. Processamento da membrana: os fragmentos do DNA serão expostos a um tratamento químico-enzimático com uma sonda de DNA e um marcador quimioluminescente que revelará os fragmentos hibridizados. • 5 – REVELAÇÃO • - As imagens das membranas são capturadas pela máquina fotográfica, inserida no sistema e transferidas eletronicamente para o computador.

37. SOUTHERN BLOT HIBRIDIZATION -A transferência dos fragmentos obtidos pela ação das enzimas de restrição do gel para uma membrana (nylon ou nitrocelulose), onde são fixados na mesma posição, formando uma cópia exata do arranjo original. -Após a fixação a membrana é colocada em contanto com uma sonda de rRNA marcada, para que haja hibridização da sonda com as seqüências complementares presentes nos fragmentos oriundos do rDNA.

39. No computador a imagem de cada gel é tratada e comparada com o banco de dados para a identificação; • Cinco marcadores de peso moleculares são distribuídos no gel, permitindo que cada coluna, representando os dados da amostra, seja normalizada de acordo com um marcador padrão, baseado na posição e intensidade das bandas; • Coeficientes de similaridades são então calculados pelo sistema (posição e peso relativo das bandas);

41. RESULTADOS • Todos os isolados que apresentam coeficientes de similaridades iguais ou maiores que 0,93% (93%) são classificados com o mesmo ribogrupo, e os que apresentam coeficientes de similaridades igual ou menores que 0,92% (92%) são isolados diferentes com padrões distintos.

43. RIBOPRINTER NOS PERMITE: - IDENTIFICAR AS REGIÕES DE VARIAÇÃO ENTRE AS ESPÉCIES • IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES E DISCRIMINAÇÃO DE SUB-ESPÉCIES; • TESTES DE ROTINA DE PRODUTOS ACABADOS, MATÉRIA-PRIMA, EQUIPAMENTOS, MEIOS E PESSOAS ETC. • DESVANTAGEM PRINCIPAL: • ALTO CUSTO DOS KITS; • DISPONIBILIDADE DO EQUIPAMENTO NO BRASIL;