Frazionamento di un lisato cellulare tramite CENTRIFUGAZIONE Capitolo 3

1. Frazionamento di un lisato cellulare tramite CENTRIFUGAZIONE Capitolo 3 Centrifugazione preparativa e analitica

2. 2. Ultracentrifugazione analitica Centrifugazione analitica è utilizzata principalmente per gli studi di macromolecole purificate o di complessi sovramolecolari isolati 1. Centrifugazione preparativa Centrifugazione preparativa permette di separare i vari elementi di un omogenato cellulare

3. Centrifughe da tavolo • Massimo volume di carico: 24 microprovette da ml 1,5/2.0 • Massima velocità (RPM): 13300 • Massima accelerazione centrifuga Centrifughe Centrifughe preparative Centrifuga tipo sorvall

4. Ultracentrifuga analitica Puo’ operare a velocita’ di 700.000 rpm (500.000g) Il rotore e’ contenuto in una camera blindata, refrigerata e sottovuoto. Il rotore è fatto in un materiale particolarmente resistente Es. TITANIO La sedimentazione è controllata da un sistema ottico per consentire l’ osservazione del materiale che va sedimentandosi

5. Ultracentrifugazione analitica viene utilizzata per determinare: -il grado di purezza di una macromolecola -la massa molecolare relativa di soluti nel loro stato nativo -le costanti di affinità tra ligandi e proteine -esaminare i cambiamenti di massa molecolare relativa di complessi sovramolecolari - studiare i cambiamenti conformazionali

6. Rotore Verticale Centrifugazione isopicnica Rotore a bracci Oscillanti Centrifugazione isopicnica massima risoluzione delle bande Tipi di rotori Rotore ad angolo fisso separazione differenziale Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

7. Che cosa è il campo centrifugo?

8. CAMPO CENTRIFUGO: Una qualsiasi particella che viene fatta ruotare all’interno di un rotore da centrifuga avrà una velocità di sedimentazione che sarà pari al campo centrifugo G applicato G = w 2r w = velocita’ angolare del rotore espressa come 2p rad r= distanza radiale (cm) della particella dall’asse di rotazione Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

9. w da cui lavelocità angolare 2p r.p.m. 60 = rad sec-1 2 r r = 4p 2 (r.p.m.)2 3600 r = distanza radiale della particella dall’asse della rotazione espressa in cm Campo centrifugo G = w 2r = 2p r.p.m. 60 lavelocita’ angolare(w) del rotore si può esprimere come velocità del rotore in giri al min=rev min-1=r.p.m. Una rivoluzione del rotore e’ pari a 360°= 2p rev min-1=2p r.p.m.

10. si esprime in g = il rapporto tra campo centrifugo G , a uno specifico raggio, e la velocità all’accellerazione normale g=981 campo gravitazionale terrestreg = 981 cm s -2 RCF=G = w 2r = 4p 2 (r.p.m)2 r g g = 1.12x10-5 r.p.m2 r = 3600 x 981 Campo centrifugo relativo (RCF) RCF= = 1.12x10-5 r.p.m.2 r RCF = rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo e il peso della particella in presenza della sola forza di gravita’

11. Le centrifughe sono provviste di NOMOGRAMMA che permettono di trasformare r.p.m in g NOMOGRAMMA Velocità del rotore (r.p.m) Forza centrifuga relativa Distanza radiale (mm) RCF (xg) Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

12. Una volta stabilito che cosa è il campo centrifugo Ci interesserà sapere quali leggi governano la sedimentazione Di una particella in quel determinato compo centrifugo relativo

13. Una miscela di particelle eterogenee, approssimativamente sferiche, può essere separata mediante centrifugazione, in base alla : 1. densità 2. dimensione delle particelle, 3. tempo di sedimentazione, 4. livello di sedimentazione raggiunto dopo un periodo di tempo definito..

14. Legge di STOKES h= coef . di viscosita’ del mezzo n =2rp2(rp -r m ) w2 r 9h rp=raggio della particella rp =densita’della particella r m=densita’ del mezzo La velocita’ di sedimentazionendi una particella e’ proporzionale alle sue dimensioni, alla differenza tra le densita’ di particella e mezzo e al campo centrifugo applicato La velocita’ di sedimentazione dipende anche dalla forma della particella: una particella allungata offre maggior attrito rispetto ad una con la stessa massa ma di forma globulare quindi le particelle allungate sedimentano piu’ lentamente

15. Quando si riportano le condizioni per la separazione di particelle bisogna quindi specificare: • la velocita’ del rotore, • dimensioni dell raggio (o tipo di rotore) • tempo di centrifugazione In sommario: La velocita’ di sedimentazionedi una particella disciolta in una soluzione dipendera’ non solo dal campo centrifugo applicato ma anche dalla: 1.massa della particella 2.Densita’ e viscosita’del solvente in cui avviene la sedimentazione e 3.dalla sua forma (sferica o allungata)

16. Coefficienti di sedimentazione Il coefficiente di sedimentazione s È dato dalla velocità di sedimentazionev su campocentrifugoGapplicato s= v/ G = v/w2r • E’ espresso in secondi e dipende dalla • temperatura • densita’ • viscosita’ del mezzo Per convenzione si usa esprimere il coefficiente di sedimentazione trovato sperimentalmente in quel valore che si otterrebbe in un mezzo la cui viscosita’ e densita’ fosse pari all’ acqua a 20°C

17. xg unita’ Svedberg vescicole Es. 5S RNA =5x10-13 sec 1unita’ Svedberg = 10-13 sec Coefficienti di sedimentazioni standard = Svedberg units Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

18. Segue…CENTRIFUGAZIONE

19. ~2µm = GFP-Sec2p DAPI Frazionamento cellulare Nuclei (P1) Vescicole secretorie (P3) Apparato del Golgi (P2)

20. S2 S1 500g 35000g Centrifugazione differenziale LT S1 S2 10g P2 P3 P1 e’ la sedimentazione successiva di particelle aventi dimensione e densità diverse

21. LT S1 Es. schematico di centrifugazione differenziale di un lisato cellulare: P2 P3 P1 S2 S1 Mitocondri ER, Golgi Vescicole ER, Golgi Membrane frammentate PM, Nucleo Lisato P2 P1 S2 S1 6500g S3 13000g 100000g

22. Esempio di Centrifugazione differenziale di GFP-Mlc1p e Sec4p CE from wt cells expressing GFP-Mlc1p P1/ S1= 6.250xg P2/ S2 = 35.000xg P3/ S3= 100.000xg Pdr5p : PM protein Sec61p :ER +Golgi protein Sec4p : vesicles and cytosol

23. Centrifugazione in gradiente di densita’: Tecnicazonale di velocita’ e isopicnica 1.Nella tecnica zonale di velocita’ le particelle si separano principalmente per differenza di dimensioni, perchè particelle biologiche di tipo simile sono spesso simili in forma e la loro densita’ rientra in una gamma ristretta. 2.Nella tecnica isopicnica:la separazione dipende dalla densita’ idrostatica delle particelle e non dalla forma ne’ dalla dimensione ed e’ indipendente dal tempo: Questa tecnica viene utilizzata per separare particelle di dimensioni similima di diversa densita’

24. Materiali usati per la formazione dei gradienti La scelta del soluto dipende dalla natura delle particelle da separare Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

25. Il campione viene fatto stratificare su un gradiente pre-formato la cui densita’ massima non deve superare quella delle particelle piu’ dense da separare campione Campo centrifugo Particelle a bassa densita’ G R A D I E T E Particelle ad alta densita’ Separazione di velocita’ su gradiente di densita’ Nota: Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma dimensioni simili non sono ben separati con questo metodo Separazione isopicnica zonale di velocità: la corsa deve essere terminata prima che le particelle raggiungano la base del tubo

26. Centrifugazione isopicnica all’equilibrio Il gradiente non è preformato ma si genera durante la centrifugazione Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma dimensioni simili sono separati con questo metodo

27. G R A D I E T E Particelle a bassa densita’ Campo centrifugo Particelle ad alta densita’ Il gradiente si forma durante la centrifugazione La centrifugazione va fatta all’equilibrio (densita’ idrostatica = a quella dell gradiente) Centrifugazione isopicnica con metodo dell’isodensita’ all’equilibrio Campione +mezzo Il campione viene mescolato con il mezzo del gradiente

28. Centrifugazione isopicnica con metodo all’equilibrio Campo centrifugo Particelle a bassa densita’ G R A D I E T E Particelle ad alta densita’ campione Il campioneviene stratificato sotto (o sopra) il gradiente la cui densita’ massima deve superare quella delle particelle piu’ dense da separare TEMPO di centrifugazione La centrifugazione va fatta all’equilibrio (densita’ idrostatica = a quella del gradiente) Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma dimensioni simili sono separati con questo metodo

29. Esempi di Sucrose Velocity gradient wt cells expressing GFP-Mlc1p

30. Esempi di frazioni 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Density gradient Gradiente di saccarosio wt cells expressing GFP-Mlc1p Cellule wt +GFPMlc1p Gradiente di saccarosio

31. Metodi di determinazione della concentrazione di proteine nel lisato cellulare Paragrafo 8.3.2

32. Metodi colorimetrici: La soluzione proteica reagisce con un reagente che da luogo ad un prodotto colorato. La quantita’ del prodotto viene quindi determinata allo spettrofotometro. Con appropriata calibratura si correla l’ intensita’ della colorazione alla quantita’ della proteina Metodi colorimetrici: Metodo di Lowry, BCA e Bradford.

33. E’ basato sull’ immediato shift di assorbimento da 465nm a 595 nm che occorre quando il colorante Comassie Brilliant blue G-250 si lega alle proteine in soluzione acida. Protein + Comassie brilliant blue Protein Dye complex (acidic, A465nm) (A595nm) Metodo di Bradford Questo metodo si basa sul legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine (non molto accurato, poco sensibile 20g/cm3) Si assume che il colorante si leghi alla proteina via attrazione elettrostatica dei gruppi acidi sulfonici del colorante. Gli studi sul meccanismo della formazione di questo complesso suggeriscono che la forma anionica del colorante e’ la specie che complessa con la proteina. Questa interazione causa lo shift di assorbimento con un picco a 595nm

34. Schema di reazione Lowry modificato = prodotto +stabile Proteine+Cu+ OH- complesso tetracoordinato-Cu+1 + Folin fenolo+ Acido Fosfomolibdenico / fosfotugstenicocomplesso colorato Blu A750nm Metodo di Lowry: rileva quantitativi proteici inferiori a 10µg/cm3. Le proteine si fanno reagire con una soluzione alcalina contenente solfato di rame in presenza di tartrato (reagente di Folin: tugstato, molibdato e fosfato di sodio) si sviluppa un colore blu porpora che assorbe ad un massimo di A 660nm Interference.: con tamponi Tris, e zwitterionici (PIPES, HEPES) o contenenti EDTA

35. Assorbimento della luce ultravioletta: utile per piccole quantita’ di proteine e per riutilizzare il campione (sensibilita’ fino a 10g/cm3) I residui aromatici della tirosina e triptofano hanno un assorbimento max a 280nm. In una miscela complessa si puo’ calcolare con buona approssimazione che una soluzione con A280= 1.0 (considerando 1cm di percorso) abbia una concentrazione proteica di circa 1mg/cm3 1 Attenzione : questo metodo e’ soggetto ad interferenza. es.: anche gli acidi nucleici assorbono a 280nm Fattore di correzione: Proteine mg/cm3 =1.55A280-0.76A260

36. Misurazione dell’ assorbanza dei legami peptidici a 205-210nm. 2 Questo metodo ha una sensibilita’ maggiore fino a >1g/cm3. Nota che: I legami peptidici assorbono ad un massimo di 190nm ma gli spettrofotometri hanno scarsa resa a queste lunghezze d’onda applicazioni: FPLC= Fast Protein liquid chromatography HPLC= High Performance Liquid Chromatography

37. METODI DI FRAZIONAMENTO delle proteine Paragrafo 8.3.4

38. Frazionamento stabilità : -denaturazione tramite temperatura Frazionamento per solubilità e/o idrofobicità: --Sali, -solventi organici, -punto isoleletrico, Frazionamento per carica: -colonne a scambio ionico

39. Frazionamento per STABILITA’ Fattori che diminuiscono la stabilità delle proteine: -Temperatura -Congelamento -Scuotimento -pH dei buffer di solubilizzazione -Ossidazione -Presenza di metalli come co-fattori -Sali

40. Precipitazione della proteina d’interesse Precipitazione delle proteine meno solubili Precipitazione delle proteine più solubili SOLUBILITA’ differenziale delle proteine Può essere un criterio di purificazione di proteine da una miscela complessa Pag 345-348 Figures from:http://biotecnologie.unipr.it/didattica/att/5cc0.file.doc

41. Frazionamento per solubilità e/o idrofobicità Precipitazione delle proteine -Precipitazione con Sali -Precipitazione con Solventi organici -Precipitazioni con PEG

42. Perche’ in presenza di sali o metanolo le proteine precipitano? quindi la loro solubilita’ sara’ diversa in presenza di concentrazioni diverse di sali o solventi organici. Le proteine differiscono nel numero di gruppi polari esposti al solvente Precipitazione della proteina d’interesse http://biotecnologie.unipr.it/didattica/att/5cc0.file.doc % del solvente

43. I gruppi idrofobici sono rivolti verso l’interno I gruppi idrofilici sono rivolti verso l’esterno. Questo permette interazioni dipolari con il solvente + H O- + H Una proteina e’ solubile in acqua fintanto che i gruppi carichi sono solvatati da molecole di acqua e i gruppi idrofobici sono mantenuti all’ interno della proteine.

44. PRECIPITAZIONE CON SALI In una soluzione acquosa contenente proteine e sali .. Se si aumenta la concentrazione di sali le molecole libere di H2O che possono solvatare gli ioni salini diminuiscono. Le prime molecole di H2O che si rendono disponibili a questo punto sono quelle che si trovano intorno ai gruppi idrofobicidelle proteine poiche’ le altre sono impegnate con interazioni elettrostatiche con i gruppi polari delle proteine e quindi sono piu’ difficilmente cedibili.

45. Na+-Cl- Na+-Cl- Na+-Cl- Na+-Cl- + + + + + H H H H H O- O- O- O- O- + + + + + H H H H H Na+-Cl- al crescere della concentrazione salina i gruppi idrofobici delle proteine vengono scoperti Na+-Cl- Na+-Cl- I gruppi idrofobici sono rivolti verso l’interno I gruppi idrofilici sono rivolti verso l’esterno. Na+-Cl-

46. Precipitazione della proteina d’interesse Precipitazione delle proteine meno solubili Precipitazione delle proteine più solubili Questiframmenti idrofobici esposticausano l’ aggregazione delle proteine e a seguito di interazioni idrofobicheche e causano la precipitazione delle proteine o ‘salting out’ . Schema di percipitazione in presenza di Ammonio solfato Naturalmente più la proteina contiene tratti idrofobici e’ piu’ risultera’ insolubile a basse concentrazioni saline (e vice versa).

47. PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI In una soluzione acquosa contenente solventi organici (metanolo, etanolo, butanolo, acetone) le molecole di acqua si dispongono a idratare le molecole di solvente organico. L’ acqua di solvatazione viene quindi rimossa dai gruppi carichi e polari sulla superficie delle proteine. I gruppi carichi delle proteine vengono quindi scoperti e le proteine si aggregano per formazione di interazioni ioniche tra le molecole proteiche.

48. + + H H O O - - + + H H + + H H I gruppi idrofobici sono rivolti verso O O - - l’ interno + + H H I gruppi idrofilici sono rivolti verso l’ esterno . + + H H O O - - + + H H + + H H O O - - + + H H I gruppi carichi delle proteine vengono quindi scoperti e le proteine si aggregano per formazione di interazioni ioniche tra le molecole proteiche

49. + H O - + H + H O - + H + H O - + H + H O - + H Di conseguenza le proteine presenti in una soluzione acquosa contenente solventi organici precipitano in ordine decrescente a seconda del numero di gruppi carichi presenti sulla loro superficie e in misura maggiore man mano che aumenta la concentrazione del solvente

50. Poly(ethylene glycol) (PEG) : HO - (CH CH O) CH CH - OH 2 2 n 2 2 Il PEG e ’ un polimero organico che precipita le proteine con un meccanismo simile a quello dei solventi organici richiede concentrazioni piu ’ basse per precipitare le proteine e ha minor probabilita ’ di . determinare la loro denaturazione PEG puo’ essere usato 1 . per guidare le proteine e acidi nucleici a formare cristalli . 2. Per purificazioni proteiche : PEG + destrano + buffer -- > e’ un sistema bi - fasico utile per ospitare materiali biologici 3.per aiutare la fusione cellulare . Il PEG interagisce con le membrane cellulari , a un processo chiave usato in biotecnologia . 4. Il legame covalente del PEG alle proteine da coniugati che non sono " - immunogenici " e antigenici = uso in vaccini . 5. Il legame covalente del PEG a superficie retarda l’ assorbimento delle proteine a queste superfici