Francesca Zito CNRS UMR 7099 Institut de Biologie Physico-Chimique

1. Francesca Zito CNRS UMR 7099 Institut de Biologie Physico-Chimique Physico-Chimie Moléculaire des Membranes Biologiques 11, rue Pierre et Marie Curie, F-75005 Paris - France zito@ibpc.fr

2. Chlamydomonas reinhardtii, il « lievito verde » • alga verde unicellulare, taglia 7-8 µm, si coltiva con le tecniche classiche di microbiologia, tempo di generazione: ~ 10h • fototrofo facoltativo (crescita su acetato): • * mutanti di fotosintesi • * studio dell ’espressione genica in vivo mediante l’uso di precursori radioattivi • accessibile alla transformazionen genetica del compartimento nucleare (integrazione aleatoria) e cloroplastico (ricombinazione omologa) • organismo sessuato

3. Chlamydomonas reinhardtii

4. Two Chlamydomonas gametes, mating.

6. mt + La segregazione dei caratteri genetici Geni nucleari eredità mendeliana Geni cloroplastici eredità materna (mt+) Geni mitocondriali eredità paterna (mt-) n n X mt - Quattro prodotti di una tetrade

7. Locus mt: cromosoma 6 Fus1: proteina strutturale necessaria alla fusione, se é « difettosa » c’é agglutinazione ma non fusione Mid : fattore di trascrizione importante per la differenziazione mt-. Un’alga Dmid avrà dei gameti pseudo+che pero’ non porteranno a fusione perché non hanno il gene fus1

8. Strumenti per la costruzione di mutanti Ceppo di Chlamydomonas deleto per il gene d’interesse Plasmide portante il gene d’interesse mutato Criterio di selezione

9. Tag histidine oligo diretto R R= SpeI R oligo inverso R= SpeI PCR R R R R Digestione con R R R R R ligazione sequenziamento R

10. cassette aadA KS- Sequenze ripetute DNA chlamy cassetta aadA excisable trnY H* Delezione del cytf petD gene H* trnY petD gene petA sensibile alla spectinomycina transformatione biolistica del cloroplasto di Chlamydomonas reinhardtii trnY H* petAgene Bg RV DNA cloroplastico petD gene Le alghe che hanno integrato la cassetta sono selezionate sulla resistenza all’antibiotico.…….ma se leviamo la pressione selettiva........... H* trnY petD gene

11. KS- aadA petA petA petA petD gene Ceppo mutante e resistente all ’antibiotico Strategia di reinserzione del frammento portante la mutazione nel genoma cloroplastico trnY petA petD gene

12. Condizioni di trasformazion del genoma cloroplstico 48 mb Pressione elio: 7 bars Vuoto: 48 mbars tiro: 20 ms Tungstène:1m de diamètre  0.5m3 108 biglie per transformazione 4 x 109 plasmidi 40 plasmidi/biglia Rendimento: 10 -5 (~ 100 transformanti/petri) 107 cells

13. aadA petA petA aadA petA selezione Minimo recupero della fototrofia Tap/spectinomycina resistenza all’antibiotico petAcytf cyt b6f necessario alla funzione fotosintetica petA non é fototrofo

14. Clorofilla eccitata Clorofilla ox Clorofilla eccitata Luce e calore Donatore D. ox Accettore + A. red - A. red - + Trasferimento di energia per risonanza Trasferimento di elettroni Fluorescenza eccitazione elettrone

15. Fotosintetici Non fotosintetici Scoprire i mutanti con la fluorescenza……. tetrade

16. Fluorescenza: curve di riferimento

17. Struttura del cloroplasto

18. La fotosintesi é localizzata in un organello, il cloroplasto, che possiede un suo proprio genoma Biosintesi dei lipidi Biosintesi di clorofille e eme Biosintesi di prenilchinoni Biosintesi di aminoacidi Biosintesi di glucidi (amido) Espressione genetica Fotosintesi reazioni primarie stroma tilacoide lume

19. Geni « sconosciuti » psbA Geni dell ’espressione genetica del cloroplasto orf-136 orf112a Wendy transposon orf-536 trnV petA orf-100 petD trn R chlB trn P psbK trnN pet L orf 58 tufA psaC trn-E1 trnF trnM trnH psbC petB chlL rpl 23 orf 2971 orf 271 orf 140 orf-121 orf-604 orf-507 rpl 2 orf-266 orf-171 trn-C rps 19 trn-T trn-R rpl 20 trn-S rpl 16 trn-W clpP trn-L rpl 14 rpl 5 psaA ex1 rps8 trn-M trn-G psbD rps 4 psaA ex2 psbJ orf-162 atpI orf-111 psaJ rps12 rrn16S trn-I trn-A orf-117a orf 1995 7s rRNA 3s rRNA rrn23S ex1 orf-163 atpB rrn23S ex 2 rrn5S Chlamydomonas reinhardtii DNA cloroplastico 204210 bps circa 120 geni orf-163 IRa orf-111b rrn16S ex5 trn A ex4 trn I IRb rrn7S ex3 rrn3S rrn23S-ex1 ex2 rrn23S-ex2 ex1 rrn5S orf-117b orf 59 trn S ycf12 ex5 orf 50 atpE rps 7 rps14 ex4 orf-117 psbM ex3 psbZ psbA ex2 ccsA trn L ex1 psaA ex3 orf-111a chlN trn E2 tscA psbH psbT/ycf8 trn K p-rpoA psbB rbcL rps2-like(orf 570) trn E orf-192 trn D Wendy disabled orf-314 p-atpF orf-550 orf-208 atpH rps18 p-rpoB ex2 cemA p-rpoB ex1 orf-112b orf-132 psbN ycf3 ycf4 rps9 psb I psbE trn M atpA p-rpo C2 psaB I geni della fotosintesi» trn Q trn Y psbL psbF petG p-rps3 (orf712)

20. Fd FNR ATP ADP + Pi a b d b a b a NADP++H+ NADPH II I e stroma g H+ E C D CP43 CP47 D1 QA PQ A B PQ D2 III A1 A1’ M G L III III III IV S X M J K W I E F L H N H G J M K I L IV-cyt b6 Lhcbi Lhcbi Lhcbi PQ N F R O Rieske T PC P H+ Q 3 H+ CP43 CP47 cyt f 2 H2O 4H++ O2 PC

21. antennes collectrices FNR Fd ATP synthétase Complessi coinvolti nel trasferimento di elettroni fotosintetico ATP ADP + Pi a b antenne d b a b a NADP++H+ NADPH stroma e II I g H+ E C D CP43 CP47 A B D1 PQ D2 PQ QA A1 A1’ III III III III IV IV-cyt b6 Lhcbi M G L Lhcbi S X M J K W I E F L H N H G J M K I L Lhcbi PQ R O N Rieske F P H+ T PC Lumen 3 H+ Q CP43 CP47 cyt f 2 H2O 4H++ O2 PC cyt b6f PSII PSI

22. nucleo cpDNA 10-1000 copie 1 : 1 tilacoide Biogenesi dei complessi fotosintetici (1)

23. L ’influenza della ploidia sulla sintesi proteica cloroplastica FdUr 0h 24h 48h FdUr P2a 0h 24h 48h LS Geni nucleari sub sua RbcS Cytf D1 Geni cloroplastici atpA Contenuto in DNA Sintesi cloro La traduzione cloroplastica resta immutata nonostante una diminuzione di 10 volte del numero di copie del genoma

24. psaA psaB rbcL atpB atpA petA psbA psbD petD Cblp2 L ’influenza dell ’accumulazione dei messaggi cloroplastici sulla sintesi proteica cloroplastica rifampicina 0 3h 6h 0 3h 6h La sintesi cloroplastica resta inalterata malgrado la diminuzione importante dell ’accumulazione dei messaggi

25. cp DNA Fattori di maturazione e stabilizzazione Fattori di traduzione Biogenesi dei complessi fotosintetici nucleo Subunità costitutive tilacoidee Il tasso di produzione dell sub-unità cloroplastiche é governato dal genoma nucleare via la produzione di fattori nucleari, in quantità limitante, che regolano specificamente le diverse tappe post-trascrizionali dell ’espressione dei geni cloroplastici

26. Codone di iniziazione: AUG gene petA * AUGAUU, ACG, ACC, ACU et UUC 20% Solo il codone UUC non accumula citocromo f * l’introduzione di un codone stop prima dell’AUG non impedisce l’accumulo della proteina la posizione codone-1 non é determinante per la traduzione Conclusione il codone mutante puo’ essere utilizzato come codone di iniziazione quindi l’AUG di petA non é necessario per l’iniziazione della traduzione ma la forza di interazione codone-anticodone potrebbe determinare il tasso di traduzione

27. Studio sui fattori cis e trans implicati nella traduzione di una proteina Complesso di iniziazione loop Fattore di regolazione psbC 5 ’ 3 ’ gene psbC  proteina CP43 del PSII Mutanti della traduzione del gene psbC *F34, mutante nucleare incapace di tradurre il gene psbC *Fud34, mutante cloroplastico incapace di tradurre il gene psbC *F34-SuI, soppressore cloroplastico della mutazione F34

28. Il loop é necessario per una traduzione corretta? ?? psbC 5 ’ 3 ’ SI!! L’eliminazione del loop impedisce la traduzione di psbC

29. Fud34 mutazione nella regione 5’UTR  stabilizzione del loop psbC 5 ’ 3 ’ Il fattore di traduzione (trans) non puo’ aprire il loop psbC 5 ’ 3 ’

30. F34-SuI soppressore cloroplastico Mutazione nella regione 5’UTR che rende il loop meno stabile psbC 5 ’ 3 ’ psbC Il CdI, anche in assenza del fattore trans, puo’ attraversare il loop e cominciare la traduzione

31. Conclusioni Nella maggior parte dei casi i messaggi dei geni non sono traducibili in assenza di attivatori della traduzione codificati dal nucleo Complesso di iniziazione loop Fattore di regolazione psbC 5 ’ 3 ’ Nel caso studiato il fattore di regolazione é necessario per aprire il loop e quindi permettere il passaggio/scanning del CdI

32. Genoma: cloroplatico nucleare I complessi della membrana fotosintetica sono composti da proteine di origine mista a b d b a b a II I e g E D C CP47 CP43 D2 A B D1 IV-cyt b6 III III III III IV H G J M K I L M G L X M J K W I E F L H N N N R F O Fe-S P T Q CP43 CP47 cyt f PSII PSI ATP synthase cyt b6f

33. La regolazione dell ’espressione dei geni cloroplastici é fatta principalmente al livello di traduzione La produzione di una subunità cloroplastica é determinata da fattori nucleari gene-specifici che controllano l ’espressione a livello post-traduzionale Cosi, nelle cellule vegetali, l ’espressione dei geni cloroplastici e ’ coordinata all ’espressione di geni nucleari

34. + + H H Citocromo b6 f + H stroma Qi PQ b PQ PQ h e- b PQH l 2 FeS Qo lumen e- f

35. WT DpetB DpetA DpetD cyt f cyt b6 IV-cyt b6 SUIV cyt f Rieske PetG L’accumulazione delle subunità di un complesso fotosintetico é un processo coordinato L’esempio del complesso citocromo b6 f Rieske

36. sintesi degradazione Accumulazione stazionaria polipeptide pulse chase

37. Il tasso di sintesi - ma non da demi-vita - del citocromo f é ridotto in assenza d’assemblaggio del complesso citocromo b6f. WT DpetD cytf In assenza dei partners di assemblaggio: I. La semi-vita-ma non il tasso di sintesi- di citb6 e subIV é diminuita II. Il tasso di sintesi- ma non la semi-vita- del citf é diminuito cytb6 suIV 0 15 30 60 120 180 0 15 30 60 120 180 t(mn) après l’addition de CAP il citocromo f é una proteina CES (Controllo per Epistasia di Sintesi): la sua sintesi é ridotta in assenza delle subunità « dominanti » del complesso

38. cyt b6 IV petA mRNA petD mRNA ISP cyt f IV cyt f ISP L’accumulationzione coordinata delle subunità del complesso citocromo b6f é il risultato di due processi di regolazione

39. SS LS RUBP Fd A B IV-cyt b6 cyt f ATPsynthase PSII cyt b6f PSI Le subunità CES (il cui tasso di sintesi é ridotto in assenza dei partners dominanti di assemblaggio) sono presenti in tutti i complessi della catena fotosintetica del cloroplasto di Chlamydomonas. a b b b a b a CP47 D2 D1 CP47

40. Per descrivere il processo CES di regolazione della traduzione abbiamo bisogno di trovare i partners coinvolti: I. La sequenza target II. Il motivo regolatore III. Il fattore nucleare di regolazione

41. Sequenza target 5’UTR CES coding sequence Il tasso di sintesi ridotto delle subunità CES non assemblate da cosa écausato? • una riduzione del tasso di sintesi • (iniziazione, allungamento?) • una degradazione precoce • (co- o post- traduzionale?)

42. Gli strumenti per lo studio del processo CES I geni chimerici 5’UTR CES coding sequence of CES Trasformazione cloroplastica reporter protein 5’UTR CES Espressione del gene chimerico in presenza e assenza della proteina dominante unrelated 5’UTR coding sequence of CES

43. orf petA 3’UTR IV-cyt b6 AFFF 5’atpA cyt f Il processo CES richiede la regione 5’ UTR del gene petA AFFF WT -IV+IV-IV+IV a-cyt f a-cyt b6 WT cyt f SU IV

44. ORF atpA FAAA 5’petA La regione 5’ UTR del gene petA é sufficiente a conferire il comportamento CES a un gene reporter. FAAA +IV -IV WT b a apoCP47 SUIV

45. a b SS b b a b LS a RUBP Fd c CP47 D2 D1 A B IV-cyt b6 CP47 cyt f ATPsynthase PSII cyt b6f PSI Nel caso del citocromo f, il processo CES é determinato dalla regolazione dell ’inizio della traduzione. E ’ anche il caso delle altre proteine CES studiate (prodotti dei geni cloroplastici atpA, psaApsaC et psbB) Quale meccanismo lega il tasso di sintesi delle proteine CES allo stato d’assemblaggio della proteina?

46. CES CES Due possibili meccanismi di controllo per la traduzione di proteine CES DOM. assembly DOM.

47. CES CES Due possibili meccanismi di controllo per la traduzione di proteine CES DOM. assembly DOM. CES un feed-back negativo mediato dalla subunità CES non assemblata

48. CES CES Due possibili meccanismi di controllo per la traduzione di proteine CES DOM. assembly DOM. CES un feed-back positivo mediato dalla subunità dominante

49. I rilascio dell’inibizione di traduzione poiché la subunità CES é assente reporter CES 5 ’-UTR Ipotesi di feed-back negativo reporter Per una proteina reporter CES-controllata Rap. CES 5 ’-UTR L’assenza di entrambe le subunità CES e DOM provocherà …..

50. CES DOM. reporter Per una proteina reporter CES-controllata Rap. CES 5 ’-UTR L’assenza di entrambe le subunità CES e DOM provocherà ….. II un rilascio della stimolazione di traduzione poiché la subunità DOM protein é assente reporter CES 5 ’-UTR Ipotesi di feed-back positivo