Thierry Hauet Inserm U927 Service de Biochimie Plate forme IBiSA

1. DIU de Transplantation 2010-2011, 3éme séminaire Ischémie reperfusion, complications métaboliques, Infections et cancers en transplantation Biologie de la cellule exposée au froidMécanismes et conséquences des lésions d’ischémie reperfusion Thierry Hauet Inserm U927 Service de Biochimie Plate forme IBiSA Fédération pour l’étude de l’ischémie reperfusion en transplantation groupe FLIRT

2. PRINCIPAUX MÉCANISMES LÉSIONNELS AU COURS DE L’ ISCHÉMIE REPERFUSION Ischémie froide Reperfusion Lésions chroniques _________ Fibrose EMT Apoptose Autophagie Lésions d’hypoxie Stress oxydant Réaction inflammatoire Lésions liées à la réoxygénation Ischémie chaude Ischémie chaude relative Lésions d’hypothermie Lésions liées au réchauffement Temps groupe FLIRT

3. MOMENTS CRITIQUES Causes de la mort Morbidités associées (HTA, dyslipidémie...) Traitementsutilisés Mort cérébrale Donneur Instabilité hémodynamique Problèmes d’oxygénation adaptée Orage végétatif Administration de vasoconstricteurs Phase de réanimation Difficultés techniques Saignement Refroidissement difficile Conservation de mauvaise qualité Duréed’ischémiefroideprolongée Prélèvement Conservation Réoxygénation et réchauffement Durée d’anastomose Facteurs immunologiques Traitement immunosuppresseur Reperfusion Devenir à long terme groupe FLIRT

4. Principaux mécanismes lésionnels au cours de la mort cérébrale groupe FLIRT

5. DEFINITIONS groupe FLIRT

6. Ischémie froide Le but principal: conserver les organes et maintenir la viabilité des différents organes ex vivo pour une période de temps qui peut aller jusqu’à 48 heures, suffisante pour le transport éventuel des organes du centre préleveur vers les centres transplanteurs, leur attribution selon le degré d’urgence, de priorité ou de meilleure compatibilité tissulaire, l’utilisation de tous les organes prélevables. La gestion de ces organes est très différente selon qu’il s’agit d’un organe vital comme le cœur le foie et le poumon, ou du rein pour lequel un retard à la reprise de fonction du greffon est tolérable grâce au recours a l’hémodialyse. groupe FLIRT

7. Principes Diminution du métabolisme de 50% par paliers de 10°C Solutions de conservation avec une composition spécifique Les lésions sont essentiellement de type nécrose tubulaire Les autres effets sont : œdème cellulaire, acidose majoration de la production radicalaire à la reperfusion 0h 6h 20h groupe FLIRT 24h

8. Ischémie tiède (CHAUDE RELATIVE) Elle caractérise la sortie du greffon du milieu de conservation Elle doit être le plus court possible Considérée comme une composante de l’ischémie chaude (ou froide?) Les mécanismes lésionnels sont mal connus groupe FLIRT

9. Ischémie chaude En normo thermie (37 °C) l’interruption de la vascularisation d’un organe (ischémie) entraîne la nécrose cellulaire rapide. L’ischémie chaude, lorsque l’organe n’est plus perfusé par le sang du donneur mais n’est pas encore réfrigéré, est une période très mal tolérée et ne doit pas dépasser quelques minutes. groupe FLIRT

10. L’oxygène…… Pour le meilleur et le pire

11. Évolution de la composition de l’atmosphère Maintenant (rapport) CO2 0,03 N2 79 O2 21 Il y a 4 milliards d’années (rapport) CO2 98 N2 1,9 O2 0

12. Cellule Mitochondrie Respiration mitochondriale La chaîne de transport des électrons NAD+ H+ NADH, H+ H2O ½O2 + 2H+ FADH2 FAD H+

13. O2 σ* 2p π*2p π*2p π2p π2p σ2p σ* 2s σ2s Configuration électroniquede l’O2 σ* 1s σ1s Oxygène fondamental Biradical (triplet)

14. L’oxygène à l’état fondamental II • La règle de multiplicité (M)définit le nombre d’électrons non appariés d’une molécule. M = 2S + 1 S représente la somme de tous les spins électroniques • Ainsi la molécule d’O2 a une multiplicité égale à 3, puisque S = (+1/2)+ (+1/2) = 1 M = (21) + 1 = 3 • L’oxygène fondamental est dit dans un état triplet

15. L’oxygène à l’état fondamental III Molécules à l’état triplet peu réactives avec les molécules à l’état singulet (Règle de restriction de spin) Molécules organiques

16. 3-5% O2 1 e- Monoréduction Échappement des électrons Complexes I et III La chaîne respiratoire Chaîne des transporteurs 95-97% Cytochrome c oxydase 4 e- Tetraréduction H2O O2

17. Le stress oxydant ….. Le côté obscure de la force

18. Antioxydant Prooxydant Radicaux libres Stress oxydant Antioxydant Prooxydant

19. Espèces Oxygénées Réactives

20. Définition de l’ischémie-reperfusion Ischémie - Reperfusion Intervention chirurgicale Thrombose Transplantation

21. Ischémie - Reperfusion Stress oxydant Inflammation EOR Infiltration leucocytaire tissulaire

22. e- Espèces partiellement réduites de l’oxygène Radicalaires ou non radicalaires Les Espèces Oxygénées Réactives (EORs) e- non appariés e- appariés Réduction de l’O2 Réduction totale O2 + 4H+ + 4 e- 2 H2O Cytochrome c oxydase Chaîne respiratoire mitochondriale

23. Notion de radical libre et définitions I • Un radical libre(RL)est constitué par tout atome, groupe d’atomes ou molécules où au moins un électron non apparié occupe une orbitale externe [] • Le radical s’en trouve doté d’une réactivité particulière et peut ainsi réagir avec d’autres atomes ou molécules et se comporter, selon le cas, comme un oxydant ou comme un réducteur, afin d’apparier son électron célibataire

24. Formation des EORs – Anion superoxyde Monoréduction de O2 O2- = Anion superoxyde e- O2°- O2 Mécanismes responsables de la formation de O2° - Exemples: NADPH oxydase Chaîne respiratoire Hémoglobine

25. Formation des EORs radicalaires ou non ONOO- 1O2 NO° hυ Fe2+, Cu+ OH e- Mécanismes responsables de la formation OH Fenton H2O2 + Fe2+ OH- + OH ° + Fe3+O2° -+Fe3+O2 + Fe2+ Haber-Weiss H2O2 + O2° - OH- + OH ° + O2 Oxydases SOD O2°- O2 H2O2 e- e- O2- = anion superoxyde OH °= radical hydroxyle ONOO-= anion peroxynitrite H2O2 = peroxyde d’hydrogène 1O2= oxygène singulet

26. Le stress oxydant et l’ischémie reperfusion Struggle for life…..

27. ATP lactate pyruvate glucose acétylCoA NADH, H+ glycolyse - O2 +O2 NADH, H+ FADH2 cycle de Krebs Du glucose à la phosphorylation oxydative groupe FLIRT

28. Désynchronisation de la chaînerespiratoire au cours de l’ischémiefroide et l’hypoxie A l’ischémie HO° O2•- H2O2 e- e- HIF II I III ANT IV V Fe MnSOD groupe FLIRT

29. Ischémie Ralentissement de la phosphorylation oxydative Accumulation des e- sur la chaîne respiratoire mitochondriale O2 Echappement des e- au niveau des complexes I et III ATP Inhibition des pompes ATP dépendantes Ca2+ ATPase O2°- O2résiduel Ca2+ intracell Xanthine oxydase Conversion Xanthine Hypoxanthine Xanthine Déshydrogénase Adénosine Xanthine Hypoxanthine NADH, H+ NAD+ Dégradation de l’ATP

30. CONSÉQUENCES DE L’ISCHÉMIE Privation d’O² et nutriments Accumulation de déchets ischémie Inhibition du métabolisme oxydatif Déplétion en ATP Glycolyse anaérobie hypoxanthine Inhibition pompes Na/K Instabilité lysosomale Acide Lactique Modification des électrolytes Œdème intraCellulaire Libération Enzymes lytiques pH ↓ • Activité protéases et phospholipases Ouverture des canaux Ca++::  Ca++ cytosol Ouverture du pore de transition Altération cytosquelette, protéines Peroxydation lipides membranaires Production radicaux libres 18/05/2011 Groupe FLIRT 30

31. Le paradoxe de la reperfusion Ischémie Reperfusion groupe FLIRT

32. Modifications de la chaînerespiratoiredurantl’ischémie reperfusion (2) A la reperfusion MnSOD H2O2 O2º- O2º- O2 II I III ANT IV V groupe FLIRT

33. Reperfusion Explosion oxydative Accumulation des e- au niveau des complexes I et III O2 O2°- Xanthine oxydase Xanthine Hypoxanthine

34. PRODUCTION D’ANION SUPEROXYDE Groupe Ischémie chaude (1h) Groupe Ischémie froide (24h) WI+CS group J3

35. Analyse par RTPCR des facteurs pro et anti-oxidant 3 jours après la reperfusion ** ** *** ** * * Nox2 * HO-1 ** SOD2 * SOD1 XHD ** * p47Phox * HO-2 ** *

36. Sources cellulaires d’ERO et d’ERN NADPH oxydase Xanthine oxydase Chaîne respiratoire mitochondriale NO synthase NO ONOO- O2 O2 - Superoxydedismutase Cyt. P450 monooxygénaseLipooxygénases Cyclo-oxygénases Myéloperoxydase NO2 HOCl H2O2 H2O Cl- Catalase/ Glutathion peroxydase O2- O2 + Cl- Fe2+ OH

37. Infiltration des polynucléaires La NADPH oxydase NADPH oxydase NADPH, H+ + 2O2 2O2º- + NADP+ + 2H+ Myeloperoxidase myeloperoxydase H2O2 + Cl- + H+ HOCl + H2O Superoxyde dismutase

38. VDAC ANT CyP-D L ’ischémie reperfusion à l ’échelle cellulaire:Effets d ’un afflux calcique intracellulaire Ca 2+ prolongée lésions cellulaires perte d’intégrité de la membrane plasmique stress oxydant: production d ’espèces oxygénéés réactives (ROS) ouverture du PTPM gonflement des mitochondries et rupture de la membrane externe groupe FLIRT

39. L ’ischémie reperfusion à l ’échelle cellulaire:Voies de déclenchement de l ’apoptose Voie 1 TNF procaspase 9 endonucléases Caspases 3, 6 7 Caspase 9 ROS Ca 2+ récepteur TNFR tBid Bcl 2 Bid Bax BclXL procaspase 8 Caspase 8 Voie 2 cytochrome C Apaf-1 apoptosome Clivage de l ’ADN groupe FLIRT

40. Pivotal Role of ROS in Stimulus-Induced EC and VSMC Growth, Survival, and Apoptosis Growth/Death Survival Signals PDGF, Thrombin, Norepinephrine, Ang II, TNF, Ox-LDL, High Glucose, VEGF Arachidonate Metabolism Cytochrome P450 Xanthine Oxidase Sources of ROS Mitochondrial Electron Transport Chain NOX-1 Oxidase ROS SAPKs Potential Targets of ROS  p38MAPK  JNKs  ERKs  Akt  NF-B   Caspases Apoptosis Growth or Hypertrophy Survival groupe FLIRT

41. L ’ischémie-reperfusion à l ’échelle cellulaire: Conséquences de la production de ROS synthèse de cytokines, pro-inflammatoires, de chemokines, de molécules d ’adhésion ONOO - H2O2 O2°- OH° Oxydation des lipides membranaires, protéines, ac. nucléiques Libération médiateurs lipidiques Isoprostanes, leucotriènes, thromboxane A2, PAF Activation de facteurs de transcription: NFkB, AP-1, Sp1 Transduction signal: PKC, MAPK HIF? activation des cellules endothéliales groupe FLIRT

42. Oxydation des molécules biologiques par les EORs Activation / répression de facteur de transcription Modification de l’expression protéique Acides nucléiques Protéines Lipides EOR Attaque radicalaire des AGPI

43. CONSÉQUENCES DE LA REPERFUSION X 100 Perico N, Lancet 2004, 364: 1814-1827 18/05/2011 Groupe FLIRT 43

44. ISCHEMIE REPERFUSION ET INFLAMMATION groupe FLIRT

45. Cascade des évènements ischémie lésions tissulaires Ligands endogènes des TLR La costimulation indispensable provient de l’ischémie via la voie des TLR • Immunité innée Engagement TLR sur DC Maturation DC • CD80 CD86 sur DC Alloantigène Migration DC vers OL II Activation des LT naifs Ag spécifique  Alloreconnaissance Evènements Ag dépendants, spécifiques Evènements Ag indépendants, non spécifiques groupe FLIRT

46. Le stress oxydant et l’ischémie reperfusion Au fil du temps…..

47. Ischémie reperfusion et conservation Hyperexpression du CMH II (favorise la présentation des cellules lésées aux lymphocytes T) Infiltration de macrophages Infiltration lymphocytaire T IR = réaction inflammatoire moduléepar la durée et la qualité de conservation (cible principale: la cellule endothéliale) Groupe FLIRT

48. Conséquences à long terme

49. HypoxiaInducible Factor - HIF Stress oxydant Inflammation Neil C. Chi, Joel S. Karliner – Molecular determinants of responses to myocardial ischemia/reperfusion injury: focus on hypoxia-inducible and heat shock factors Cardiovascular Research 61 (2004) 437– 447 groupe FLIRT

50. Expression de gènes exprimés dans la période du développement: LIF…. Transition épithelio-mesenchymateuse Développement de la fibrose rénale et des lésions chroniques/Régénération Favoriser la régénération Lésions ischémiques Lésions des capillaires péritubulaires Phénomènes Thrombotiques Hypoperfusion tissulaire HIF FIBROSE signalisation de HIF groupe FLIRT