Coordenador: Marcio Alvarez Silva

1. Avaliação de procedimentos terapêuticos na utilização de células tronco mesenquimais no Acidente Vascular Cerebral Coordenador: Marcio Alvarez Silva Equipe: Andrea Gonçalves Trentin, Maristela Maria Martini, Juçara Loli de Oliveira, Marcos dos Anjos, Diego Amarante da Silva

2. ObjetivoObter e amplificar ex vivo CTMs humanas de placenta obtidos de neonatos a termo, assim como obter, caracterizar e reprogramar as CTMs obtidas para o fenótipo neural. Este ponto é importante para comparar a metodologia de utilização de enxerto de CTMs obtidas da placenta, no tratamento para AVC associando CTMs com a terapêutica de reabilitação hospitalar pós AVC.

3. Objetivos específicos Estabelecimento de um modelo experimental de lesão isquêmica para avaliação de enxertos. Investigar os padrões de neuroproteção, neurogênese e recuperação funcional de animais isquêmicos transplantados com células-tronco da placenta e, ao mesmo tempo, submetidos ao bloqueio da ativação microglial pela minociclina. Avaliar forma qualitativa e quantitativa a evolução do processo neurodegenerativo após isquemia. Investigar os efeitos do enxerto de células-tronco da placenta sobre os padrões histopatológicos de animais isquêmicos, utilizando parâmetros incluindo área de lesão, número de neurônios adultos e recém formados (neurogênese), axônios lesados, corpos de oligodendrócitos e células apoptóticas. Estudar as melhores condições para a amplificação de CTMs in vitro, para geração de uma matriz competente de larga utilização para utilização na regeneração de lesão cerebral. Avaliar a expressão de fatores de transcrição importantes em manter o estado indiferenciado das CTMs, como indicador de pluripotencialidade: oct3/4, Rex1, Nanog, FoxD2, Sox2. Avaliar os custos específicos para a implantação da metodologia em Centros de Terapia Celular (CTCs), a ser implantada nas Unidades Terapêuticas vinculas ao SUS.

4. Obtenção de CTMs derivada de placenta: Em associação com HU/UFSC obtivemos a placenta de recém- natos a termo, as células são obtidas por dissociação mecânica e enzimática. Metodologia

5. Citometria de Fluxo: Através do ensaio de citometria de fluxo, avaliamos a expressão de marcadores de superfície específicos pelas CTMs isoladas Metodologia

6. Diferenciação in vitro das CTMs: analisamos a potencialidade de CTMs, como controle de qualidade da preparação, através de diferenciação celular, pela adição de fatores descritos para diferenciação de células progenitores multipotentes humanas de medula. Metodologia

7. Transfecção do plasmídeo EGFP em CTMsOs plasmídeos GFP foram transfectados nas CTMs quando apresentarem em torno de 80-90% confluentes, através da diferentes metodologias. Metodologia

8. Modelo experimental de isquemia: Camundongos C57/BL6 adultos foram anestesiados e submetidos a isquemia cerebral, por eletrocauterização de um ramo distal da artéria cerebral média. Metodologia

9. Análise imunocitoquímica e fenotípica: Os cortes histológicos preparados 30 e 60 dias após o enxerto serão fixadas com paraformaldeído 4% durante 30 minutos em temperatura ambiente, sendo lavadas posteriormente com PBS. O material foi submetido a avaliação histopatológica. Metodologia

10. Avaliação motora: após o 1° e 3º dia da lesão isquêmica, e posteriormente no 7º, 14° e 21°, seguindo a escala de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB), preconizada pela Ohio State University (OSU), que envolve a observação e o escore de 10 comportamentos incluindo tórax, cauda e as patas traseiras direita e esquerda. Metodologia

11. Reação de polimerase em cadeia via transcriptase reversa (RT-PCR): As culturas foram preparadas e após 4 dias analisadas quanto a expressão de diferentes proteínas através da extração de RNA total para ensaios de RT-PCR. O RNA total destas amostras foram purificados utilizando reagente TRIZOLTM. A fita de DNA complementar (cDNA) será sintetizada para as analises. Metodologia

12. Resultados e Discussão

13. Resultados e Discussão Plasticidade de células-tronco mesenquimais

14. Resultados e Discussão Plasticidade de células-tronco mesenquimais (A) morfologia celular fibroblastóide: (B) diferenciação celular para adipócitos e (C) diferenciação celular em osteócitos.

15. Resultados e Discussão CD 45 FITC CD 105 PerCP Imunofenotipagem de células-tronco mesenquimais: baixa expressão de CD45 (0,6%) e expressão de CD73 (75%), CD90 (66,5%) e CD105 (62%). CD 73 PE CD 90 FITC

16. Resultados e Discussão: Expressão de Nanog e Oct-4

17. Resultados e Discussão CTMs foram co-cultivadas com as culturas mistas de cerebelo de camundongos

18. Resultados e Discussão Caracterização de culturas mistas realizadas através do cerebelo (A, C, E) e córtex (B, D, F)de camundongos. B-tubulina III (A, B),GFAP (C,D) e NeuN (E,F).

19. Resultados e Discussão Expressão de marcadores imunofenotípicos das CTMs quando co-cultivadas com culturas mistas de cerebelo (A,C e E), e córtex (B,D e F) . As CTMs expressaram marcadores como B-tubulina III (A, B), GFAP (C,D) e Nestina (E,F).

20. Resultados e Discussão A B-Tubulina III B- Nestina C- GFAP D- Nanog E- GAPDH, Cerebelo Cortex

21. Resultados e Discussão

22. Resultados e Discussão

23. Resultados e Discussão Lesão isquêmica experimental na região cortical do cérebro de camundongo (B, D). Cortex controle (A, C).

24. Resultados e Discussão Transfecção de CTMs com o gene EGFP para enxerto em modelo experimental de lesão isquêmica.

25. Resultados e Discussão Infiltração de CTMs marcadas na área da lesão

26. Resultados e Discussão Avaliação motora, em andamento

27. Impactos do Projeto – Científico Esperamos ao termino deste Projeto, ter um panorama da expressão de fatores de transcrição na seleção de CTMs com alto potencial de neuroplasticidade. Neste trabalho classificaremos a melhor combinação entre a expressão de fatores de transcrição (oct3/4, Rex1, Nanog, FoxD2, Sox2). Um ponto importante é o controle na expressão destes fatores de transcrição em CTMs diferenciadas ou em um nicho neuronal.

28. Aplicabilidade para o SUS Determinação da melhor condição de cultura para a amplificação ex vivo de células tronco mesenquimais, estabelecendo um protocolo, para aumentar a possibilidade do sucesso terapêutico. Definir protocolos para amplificação e reprogramação fenotípica de CTMs. Determinação da melhor condição de cultura para a amplificação ex vivo de células tronco mesenquimais, estabelecendo um protocolo, para aumentar a possibilidade do sucesso terapêutico.

29. Aplicabilidade para o SUS Aproveitamento racional de tecidos ricos em CTMs para utilização clinica. A determinação dos custos para implantação da técnica do enxerto no SUS, assim como sua viabilidade para atender um maior numero de pacientes.

30. Produção Científica Anais de congresso: MARTINI, Maristela Maria, MAROSTICA, L. L., TRENTIN, Andréa Gonçalves, ALVAREZ-SILVA, Marcio. A influencia do microambiente na diferenciação de células tronco mesenquimais de placenta humana In: V Congresso Brasileiro de Células-Tronco e Terapia Celular, 2010, Gramado. Anais de Congresso. , 2010. p.160 - 160 KOHLER, M. C., TRENTIN, Andréa Gonçalves, ALVAREZ-SILVA, Marcio. Avaliação da expressão dos genes NEPH em células tronco mesenquimais obtidas de placenta humana In: V Congresso Brasileiro de Células-Tronco e Terapia Celular, 2010, Gramado. Anais de Congresso. , 2010. p.87 - 87 MAROSTICA, L. L., VITURI, C. L., MARTINI, Maristela Maria, TRENTIN, Andréa Gonçalves, ALVAREZ-SILVA, Marcio. Influencia do meislato de imatinibe na proliferação in vitro das células tronco mesenquimais de placenta humana In: V Congresso Brasileiro de Células-Tronco e Terapia Celular, 2010, Gramado. Anais de Congresso. , 2010. p.159 – 159.  Artigos em fase final de preparação: Maristela Maria Martini, Talita da Silva Jeremias, Maria Cecília Kohler, Rossana Simão, Andréa Gonçalves Trentin and Marcio Alvarez-Silva ‌*. Human placenta-derived mesenchymal stem cells acquire neural phenotype under appropriate niche conditions, parasubmissãonaDNA AND CELL BIOLOGY. Maria Cecilia Kohlera;b, Talita da Silva Jeremiasb, Maristela Maria Martinib, Rosana Simãob, Andréa Gonçalves Trentinb, Marcio Alvarez-Silvab*. Human placenta-derived mesenchymal stem cells achieve neural morphology with inductive chemical medium. Para submissãonaExperimental Neurology. Lucas L. Marostica1, Cidônia de Lourdes Vituri2, Andréa G. Trentin1, Marcio Alvarez-Silva1+. Effects of ImatinibMesylate in culture of mesenchymal stem cells derived from human placenta. Para submissão no Anti-Cancer Drugs.

31. A formação de recursos humanos e um dos objetivos de nossa Proposta. Temos em andamento as seguintes orientações vinculadas a este Projeto de Pesquisa: Dissertações de mestrado DIANA HECK. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO ÓSSEA DE CÉLULAS TRONCO DE PLACENTA HUMANA EM ARCABOUÇO HIDROGEL. 2010. Dissertação (Biologia Celular e do Desenvolvimento) - Universidade Federal de Santa Catarina Diego Amarante da Silva. Avaliação de recursos terapêuticos em Acidente Vascular Cerebral. 2009. Dissertação (Biologia Celular e do Desenvolvimento) - Universidade Federal de Santa Catarina Teses de doutorado Rogerio Gargioni. Avaliação do nicho molecular de células tronco hematopoéticas e mesenquimais em placenta humana. 2009. Tese (Biologia Celular e do Desenvolvimento) - Universidade Federal de Santa Catarina Maristela Maria Martini. Diferenciação de células tronco mesenquimais humanas para o fenótipo neural: efeitos do nicho encefálico. 2009. Tese (Neurociências) - Universidade Federal de Santa Catarina Juçara Loli de Oliveira. Estudo de Células Tronco de Placenta Humana Aplicadas em Lesões decorrentes de Isquemia Cerebral em Camundongos. 2009. Tese (Biologia Celular e do Desenvolvimento) - Universidade Federal de Santa Catarina Aloiso Luiz Benedetti. Uso de células tronco mesenquimais para amplifcaçãoex vivo de células tronco hematopoéticas. 2009. Tese (Farmácia) - Universidade Federal de Santa Catarina Iniciação científica Mariane Dahmer. Avaliação de procedimentos terapêuticos na utilização de células tronco mesenquimais no Acidente Vascular Cerebral. 2010. Iniciação científica (Bacharel em CienciasBiologicas) - Universidade Federal de Santa Catarina Considerações Finais