REDOX-POTEN CIÁL M ÉRÉSEN ALAPULÓ GYORS MIKROBIOLÓGIAI MÓDSZER

1. REDOX-POTENCIÁL MÉRÉSEN ALAPULÓ GYORS MIKROBIOLÓGIAI MÓDSZER Reichart Olivér Szakmár Katalin

2. Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 1. Klasszikus (tenyésztéses) módszerek • Hosszú inkubációs idő (1-4 nap) • A módszerek alkalmazhatósága, megbíz-hatósága és költsége tartományfüggő Nagy koncentrációknál: Hígítás és telepszámlálás a 30-300 cfu/ml tartományban Alacsony koncentrációknál: MPN módszerMembrán szűrés

3. Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 2. Gyors mérési módszerek 1. (sejtszámlálás alapján) • Direkt számlálás • Számlálókamra • Flow cytometer Csak tiszta folyadékban alkalmazható • Turbiditásmérés Csak tiszta folyadékban alkalmazható

4. Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 2 Gyors mérési módszerek 2. (Anyagcseretermék detektálása alapján) • ATP mérés Csak 105 sejt felett alkalmazható • Impedancia mérésen alapuló módszerek • Malthus • Rabit • Bactrac

5. Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 3. Impedimetriás gyors módszerek • Nagy pontosságú termosztát-igény miatt nagyon drága berendezés. • Speciális, kis vezetőképességű szubsztrátot igényel. • Probléma a szelektív szubsztrátokkal. • A mérő cellák geometriája és térfogata adott. • Kis koncentrációknál megbízhatatlan.

6. Redoxpotenciál mérésen alapuló módszer elvi alapjai Kémiai reakció általános formában: a A + b B c C + d D [C]c [D]d Q = ------------ [A]a [B]b

7. Szabad energia és elektromos munka DG = DG° + R T ln Q DG = - n FDE. -n FDE = - n FDE° + R T ln Q

8. Elektromotoros erő R T [C]c [D]d DE = DE° - ------- ln --------- n F [A]a [B]b

9. Biológiai rendszerekben • Energiaforrás a biológiai oxidáció, ami a környezetben redukciót eredményez. • A környezet redukciójának okai lehetnek: Oxigén elfogyasztása Redukált komponensek feldúsulása • Tipikus oxidációs-redukciós reakciók biológiai rendszerekben: [Oxidant] + [H+] + n e- [Reductant]

10. Nernst egyenlet: RT [reductant] Eh = E0- ---- ln ------------------- nF [oxidant] [H+] RT [oxidant] [H+] Eh = E0 +----- ln ------------------- nF [reductant] Eh: a normál hidrogén elektródra vonatkoztatott redoxpotenciál (V) E0: A rendszer normál redoxpotenciálja (V) R: Gáz-állandó R = 8.314 J/mol K F: Faraday állandó F = 9.648˙104 C/mol (J/V mol) n: elektronok száma a redox-reakcióban (n=1)

11. Mikroba-szaporodás redox-görbéje

12. Különböző baktériumok redox-görbéi

13. A kezdeti sejtszám hatása a redox-görbére

14. Detektációs kritériumok Impedimetriás módszerek RABIT: admittancia változás > 5 S/6min BACTRAC: impedancia változás > 5% Redox-potenciál mérés: |E/ t|>1mV/min Detektációs idő (TTD): A detektációs kritérium eléréséhez szükséges idő

15. A kezdeti sejtszám hatása a detektációs időre

16. Mérőcella redoxpotenciál méréshez 1.

17. Mérőcella redox-potenciál méréshez 2.

18. Indirekt mérőcella

19. Mérőcella hatása a redox-görbére

20. Enterococcus faecalis különböző cellákban mérve

21. 12 csatornás mérő-rendszer • Vízfürdő • Mérőcellák • Adatgyűjtő • Computer • Monitor • Software for Windows

22. Termékben való közvetlen mérés

23. Termékben való közvetlen mérés

24. 16 csatornás mérési elrendezés

25. 32 csatornás mérési elrendezés

26. 2 csatornás mérési elrendezés

27. Mozaik elrendezésű képernyő

28. Csoportosított gráfok

29. Mérési eredmények megjelenítése

30. Mérési eredmények megjelenítése

31. Mérési módszer validálása

32. Teszt-mikrobák és táptalajok1.

33. Teszt-mikrobák és táptalajok2.

34. A módszer validációs jellemzői 1. • Szelektivitás A szelektív médium által adott. • Linearitás 1-től 107cfu/mérőcella.

35. Enterococcus szelektív kimutatása azid levesben

36. Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, E. coli és Enterococcus faecalisCetrimid-levesben

37. Enterococcus faecalis meghatározás linearitása

38. Pseudomonas aeruginosameghatározás linearitása

39. E. coli linearitása lemezöntéssel és membránszűréssel

40. Impedimetriás és redox-módszer összehasonlítása

41. A módszer validációs jellemzői 2. • Érzékenység • Kimutatási határ (Detectation limit) 1 cell/test flask. • Meghatározási határ (Quantitation limit) Elméleti meghatározási határ 10 sejt/inoculum (1 log egység), ami megegyezik a kapott kalibrációs görbékkel.

42. A módszerek érzékenysége

43. A módszer validációs jellemzői 3. • Tartomány A kalibrációs görbék alpján 1-7 nagyságrend. 10 sejt alatt a Poisson eloszlás okoz problémát, 107sejt felett a TTD túl rövid a tranziens folyamatokhoz képest (hőmérséklet-, redox-egyensúly, lag-periódus). • Ismételhetőség A kalibrációs görbékből számítva: SDlgN = 0.092 SDN = 100.092 = 1.24 = 24%

44. A módszer validációs jellemzői 4. • Zavartűrés (Robustness) Legfontosabb paraméter a hőmérséklet, amely két módon befolyásolja az eredményeket: • szaporodási sebesség hőmérséklet-függése • redox-potenciál hőmérséklet-függése A mikroba szaporodási optimumán mérve, a szaporodási sebesség ±0.5 °C intervallumon belül nem változik. A hőmérséklet-ingadozás redoxpotenciálra kifejtett hatása kísérleti eredményeink szerint elhanyagolható.

45. Hőmérséklet hatása a redox-potenciálra

46. A hőmérséklet hatása a mérési módszerekre • Impedimetriás módszerek: • A mért impedancia erősen hőmérséklet-függő. • A detektációs kritériumok (5µS RABIT-nál, vagy 5% növekedés BACTRAC esetében) már 0.025°C hőmérséklet-változással elérhetőek (RABIT Manual). • Ez az oka a szigorú hőmérséklet-szabályozási követelménynek (T=±0.002°C). • Redox-potenciál mérés: • A mért redox-potenciált döntően csak a mikroba-szaporodás határozza meg. • A hőmérséklet-ingadozás hatása elhanyagolható.

47. Impedimetriás és redox mérési módszerek hőmérséklet-érzékenysége

48. A redox-módszer alkalmazása • Víz mikrobiológiai ellenőrzése • Össz-mikrobaszám • Coliform, E. coli • Pseudomonas aeruginosa • Enterococcus faecalis • Nyers tej mikrobiológiai minősítése • Össz-mikrobaszám • Enterobacteriaceae • Hús mikrobiológiai ellenőrzése • Össz-mikrobaszám • Enterobacteriaceae • Felületek mikrobiológiai ellenőrzése • Össz-mikrobaszám • Enterobacteriaceae • Penész- és élesztőgombák számának meghatározása

49. Víz mikrobiológiai vizsgálatokÖsszcsíra

50. Víz mikrobiológiai vizsgálatokColiformok