Enzimvizsgálati módszerek Kitináz aktivitás mérése

1. Enzimvizsgálati módszerekKitináz aktivitás mérése

2. Bevezető • A növények folyamatosan ki vannak téve a fertőzés veszélyének, mivel rajtuk vírusok, baktériumok telepednek meg. • A növényvédelemben a kutatások egyre inkább a mikrobiológiai megoldások felé fordulnak. • Napjainkban ez nagyon fontos lehet, hiszen az új eredményekkel a növényvédő szerek használatát lehetne kiváltani, melyek jelenleg még nagy mértékben terhelik a környezetet.

3. Bevezető • A kitin (C8H13O5N)n egy hosszú polimer láncmolekula (poliszacharid), melyet N-acetil-D-glükózamin molekulák alkotnak, ezek a monomerek β (1-4) kötésekkel kapcsolódnak • A természetben nagy mennyiségben fordul elő: legismertebb, hogy az ízeltlábúak külső vázát alkotja, de a gombák, baktériumok sejtfalának is egy fő komponense. • A kitin acetil-glükózaminná való hidrolízisét két enzim végzi: a kitináz, és a kitobiáz. A kitinázok gyakoriak a természetben, baktériumok, gombák, és növények termelik, és termelődik a kitint tartalmazó táplálékot fogyasztó állatok emésztőmirigyében. A növényekben ez az enzim a mikrobiális fertőzésekre való válaszadóként működik.

4. Kitinázok • A kitinázok fontos szerepet játszanak a gombák elleni védekezésben. • Ezek hidrolitikus enzimek, ezért képesek hidrolizálni a kitint, amely az egyik legfőbb sejtalkotója nagyon sok növénypatogén gombának. • A legújabb kutatások között egyik azon az elven alapult, hogy olyan géneket építenek be növények genetikai állományába melyek kitináz enzimet képeznek. • A talajban lévő kitinázaktivitás a talajban lefelé haladva csökken. Jelentős kapcsolatot találtak a kitináz aktivitás, és a nitrogéntartalom között.

5. A módszer alapelve • Kitin szuszpenziót tartalmazó talajmintát inkubálnak 16 órán keresztül 37°C-on. A felszabaduló N-acetil-glükózamint KCl-dal választják el, és spektrofotometriás módszerrel határozzák meg.

6. Agyagok és berendezések • centrifuga és centrifugacsövek • cellulóz dialízis cső • spektrofotométer • polipropilén-textil (70 µm finomságú) • 100°C-ig állítható vízfürdő • Erlenmeyer lombikok (25, 100, 1000 ml) • Mérőlombik (50 ml) • Papír filter • Keverőedény

7. Vegyszerek, oldatok 1.Kitin oldat (5% tömeg/térfogat) • 15 g kitint összekeverünk 200 ml tömény HCl-val, és szobahőmérsékleten 3 órán keresztül rázatjuk. A szuszpendált kitint vákuum alatt átszűrjük a polipropilén-textilen. • A részecskementes oldatot az éjszaka folyamán vízáramban dializáljuk, majd centrifugáljuk. • Ekkor eltávolítjuk a felülúszó folyadékot, és a kitint reszuszpendáljuk desztillált vízben. • A dialízist addig ismételjük, míg a kitin-szuszpenzió pH-ja el nem éri az 5.5 – 6-os tartományt. • Miután meghatároztuk a száraz tömegét a kitinnek, készítünk egy 5%-os vizes oldatot. • Végül a szuszpenziót homogenizáljuk, majd 0,2 g NaN3-ból készített 1000 ml-1 szuszpenziót adunk hozzá. • Tárolása 4°C-on.

8. Vegyszerek, oldatok Foszfát puffer (0,12 M pH 6.0) • 700 ml desztillált vízben feloldanak 16.13 g KH2PO4-ot, 0,2 g Na2HPO4*2H2O-ot, és 0.2 g NaN3-ot, NaOH-dal, vagy HCl-dal beállítják a 6-os pH-t, és felhígítják desztillált vízzel 1000 ml-re. Borát puffer (0,8 M pH 9.1) • 40 ml 0.8 M-os KOH-ban feloldanak 4.95 g H3BO3-ot, hozzáadnak 20 ml desztillált vizet, a pH-t 9.1-re állítják 0.8 M-os KOH-val, és desztillált vízzel 100 ml-re egészítik ki.

9. Vegyszerek, oldatok KCl oldat (2 M) • 700 ml desztillált vízben feloldanak 149.12 g KCl-ot, és desztillált vízzel 1000 ml-re hígítják. 4-(dimetil-amino)benzo-aldehid törzsoldat (DMBA) • 87.5 ml koncentrált ecetsav és 12.5 ml koncentrál HCl elegyében feloldanak 10 g DMBA-et. 4°C-on tárolják.

10. Vegyszerek, oldatok Higított DMBA oldat • 1:4 arányban vegyítenek DMBA törzsoldatot koncentrált ecetsavval. Minden nap új oldat elkészítése szükséges. N-acetil-glükózamin standard oldat (45 mM) • 30 ml desztillált vízben feloldanak 0.5 g N-acetil-glükózamint, majd felhigítják 50 ml-re. Minden nap új oldat elkészítése szükséges.

11. Eljárás • Erlenmeyer lombikba teszünk 1.0 g nedves talajmintát, hozzáadunk 5 ml foszfát puffert. • 5 ml kitinszubsztrát oldat hozzáadása után a lombikot gumikupakkal lezárjuk, és 16 órán át 37°C-on inkubáljuk. • Felügyelet alatt a szubsztrátoldatot rögtön az inkubálási periódus végén adjuk hozzá. • Az inkubálás után 10 ml KCl oldatot teszünk hozzá, majd szobahőmérsékleten 30 percig rázatjuk. • Ezt követi a szuszpenzió szűrése. • A szűrlet 0.5 ml-éhez 1.5 ml desztillált vizet, 0.4 ml borát puffert adunk, és 3 percig vízfürdőben forraljuk. • Szobahőmérsékletűre hűtjük 5 ml higított DMBA oldattal alaposan elkeverjük, és 30 percig 35°C-on inkubáljuk. • Az optikai sűrűséget 20 percen belül 585 nm-en mérjük. • Minden értékelésről legalább egy másolatot készítünk.

12. Kalibrációs görbe • Négy mérőlombikba 12.5 ml foszfát puffert, 25 ml KCl oldatot, N-acetil-glükózaminból pedig pipettával bemérjük a következő mennyiségeket: 0, 0.5, 1.0 és 2.5 ml. • Desztillált vízzel felhigítjuk őket 50 ml-re. • Mindegyik oldatból 0.5 ml-t pipettázunk kémcsőbe, és a fent említettek szerint végezzük ez az N-acetil-glükózamin vizsgálatát. • A N-acetil-glükózamin koncentrációk a kalibrációs görbén a következők: 0, 50, 100, 150, 200 és 250 µg ml-1.

13. Számítás • Pontosítsuk az adatokat a vak mintára, és a következőképpen számoljunk: • N-acetil-glükózamin (µg g dwt-1 16-1) = • C: a mért N-acetil-glükózamin koncentráció (µg/ml) • V: a végtérfogat, amit a talajmintához adunk (20 ml) • dwt: a száraz tömege 1 g nedves talajmintának (dry weight of 1 g moist soil) C x v dwt

14. Forrás • Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 • http://www.viragcenter.hu - kép