药剂学 Pharmaceutics

药剂学Pharmaceutics 厦门大学医学院药学系

第三章 灭菌制剂与无菌制剂

第一节概述 • 灭菌制剂与无菌制剂是指直接注射于体内或直接用于创面、黏膜等的一类制剂。 • 灭菌法是将所有微生物的繁殖体和芽胞杀灭或除去的方法或技术。 • 无菌操作法是将制备过程控制在无菌环境下进行操作的一种技术或控制技术。 • 所谓的菌就是微生物，包括细菌、真菌、病毒等。微生物的种类不同、灭菌方法不同，灭菌效果也不同。

消毒（disinfection）是指采用物理和化学方法将病原微生物杀死的技术。消毒（disinfection）是指采用物理和化学方法将病原微生物杀死的技术。 • 防腐(antisepsis)系指用物理或化学方法抑制微生物的生长与繁殖的手段。 • 药剂学中采取灭菌措施的基本目的是既要除去或杀灭微生物，又要保证药物的稳定性、治疗作用及用药安全。因此选择灭菌方法时必须结合药物的性质加以全面考虑。故灭菌法的研究对保证产品质量有着重要意义。

一、灭菌制剂与无菌制剂 • 灭菌制剂：系指采用某一物理、化学方法杀灭或除去所有活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。 • 无菌制剂：系指采用某一无菌操作方法或技术制备的不含任何活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。 • 无菌制剂包括：注射用制剂，眼用制剂；植入型制剂；创面用制剂；手术用制剂等。

二、灭菌与无菌技术 • 目的：杀灭或除去所有微生物繁殖体和芽孢，最大限度地提高药物制剂的安全性，保护制剂的稳定性，保证制剂的临床疗效。

灭菌法的分类方法如下： • 在制药工业中常用且可靠的的灭菌方法为热灭菌法。本节重点介绍物理灭菌法，其它灭菌法简略说明。

二、物理灭菌技术 1、热灭菌法（thermal sterilization）加热可以破坏蛋白质与核酸中的氢键，导致蛋白质变性或凝固，核酸破坏，酶失去活性，致使微生物死亡。热灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌，灭菌所需热量与灭菌量、灭菌时间、湿含量等有关。（1）．干热灭菌法干热灭菌法（dry heat sterilization）有火焰灭菌法和干热空气灭菌法。

1)火焰灭菌法 直接在火焰中烧灼灭菌的方法。灭菌迅速、可靠、简便，适用于耐火焰材质的物品，如金属、玻璃及瓷器等用具的灭菌，不适用于药品的灭菌。 • 2)干热空气灭菌法在高温干热空气中灭菌的方法。由于干燥状态下微生物的耐热性强，必须长时间受高热的作用才能达到灭菌的目的。一般认为繁殖性细菌在100℃以上干热1h即可被杀死，而耐热性细菌芽胞在140℃以上时才能使杀菌效率急剧增长。在180℃，灭菌2h或在260℃，灭菌45min对于细菌芽胞的杀菌能力如同繁殖体。

有关灭菌条件，有的药典规定为135～145℃灭菌需3～5h；160～170℃灭菌需2～4h；180～200℃灭菌需0.5～1h。这只是一般标准，必须通过实验，在保证灭菌物品无损害的前提下指定完全灭菌的温度与时间。有关灭菌条件，有的药典规定为135～145℃灭菌需3～5h；160～170℃灭菌需2～4h；180～200℃灭菌需0.5～1h。这只是一般标准，必须通过实验，在保证灭菌物品无损害的前提下指定完全灭菌的温度与时间。 • 此法适用于耐高温的玻璃制品、金属制品以及不允许湿气穿透的油脂类和耐高温的粉末化学药品等。粉针的无菌瓶的干燥常采用干热灭菌法。热源经250℃，30min，或200℃以上45min，可遭破坏。 • 本法的缺点是穿透力弱，温度不易均匀，而且灭菌温度较高，灭菌时间较长，不适于橡胶、塑料及大部分药品。

（2）．湿热灭菌法 湿热灭菌法是在饱和蒸气或沸水或流通蒸气中进行灭菌的方法。由于蒸气潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以灭菌效率比干热灭菌法高。 1）热压灭菌法用压力大于常压的饱和水蒸气加热杀灭微生物的方法。此法具有很强的灭菌效果，灭菌可靠，能杀灭所有细菌繁殖体和芽胞，是在制剂生产中应用最广泛的一种灭菌方法。

热压灭菌所需的温度（蒸气表压）与时间的关系如下：116℃(67kPa)，40min；121℃(97kPa)，30min；126℃(139kPa)，15min。凡能耐高压蒸气的药物制剂、玻璃容器、金属容器、瓷器、橡胶塞、膜过滤器等均能采用此法。 • 影响湿热灭菌的主要影响因素有：a微生物的种类与数量；b蒸汽性质；c药品性质和灭菌时间；d其他

卧式热压灭菌柜，是一种大型灭菌器，如图所示，全部用坚固的合金制成，带有夹套的灭菌柜内备有带轨道的格车，分为若干格。灭菌柜顶部装有压力表，指示灭菌柜室内的压力。灭菌柜的上方还应安装蒸气排除阀，以便开始通入加热蒸气时排除不凝性气体。卧式热压灭菌柜，是一种大型灭菌器，如图所示，全部用坚固的合金制成，带有夹套的灭菌柜内备有带轨道的格车，分为若干格。灭菌柜顶部装有压力表，指示灭菌柜室内的压力。灭菌柜的上方还应安装蒸气排除阀，以便开始通入加热蒸气时排除不凝性气体。

操作方法是： • 在使用前将柜内用刷子洗净。 • 先开夹套中蒸气加热10分钟，夹套压力上升至所需压力时，将待灭菌的物品置于铁丝篮中，排列于格车架上，推入柜室，关闭柜门，并将门匝旋紧。 • 待夹套加热完成后，将加热蒸气通入柜内，当温度上升至规定温度（如115.5℃）时，将此时刻定为灭菌开始时间，柜内压力表应固定在规定压力（如，表压70kPa左右）。 • 在灭菌时间到达后，先将蒸气关闭，排气，当蒸气压力降至“0”时，柜门即可开启，待冷却后将灭菌物品取出。

注意事项： • ①必须使用饱和蒸气； • ②必须将灭菌器内的空气排除。如果灭菌器内有空气存在，则压力表上的压力是蒸气与空气二者的总压并非纯蒸气压，温度达不到规定值。而且实验证明，加热蒸气中含有1%空气时，传热系数降低60%。这些直接影响灭菌效果，因此灭菌器上往往附有真空装置，通入蒸气前将器内的空气抽出；

③灭菌时间必须由全部药液温度真正达到所要求的温度时算起。通常测定温度是灭菌器内的温度，不是灭菌物内部温度，因此最好能设计直接测定被灭菌物内温度的装置或使用温度指示剂； • ④灭菌完毕后停止加热，必须使压力逐渐降到0，才能放出锅内蒸气，使锅内压力和大气压相等后，稍稍打开灭菌锅，待10min～15min，再全部打开。以避免锅内外压差太大、温差太大而使物品冲出和使玻璃瓶炸裂，保证操作人员的安全。

国内对水针车间的GMP规范化的全面要求，使灭菌器械得到充分的开发与应用。绝大多数GMP认证车间已经采用全自动灭菌器，根据灭菌温度和时间的设定条件将操作温度与时间自动记录与控制，自动计算出F0值，以判断灭菌的完全与否。下图为平移门安瓿水浴灭菌器的流程图。国内对水针车间的GMP规范化的全面要求，使灭菌器械得到充分的开发与应用。绝大多数GMP认证车间已经采用全自动灭菌器，根据灭菌温度和时间的设定条件将操作温度与时间自动记录与控制，自动计算出F0值，以判断灭菌的完全与否。下图为平移门安瓿水浴灭菌器的流程图。

安瓿水浴灭菌器是目前国际上对安瓿针剂、口服液等瓶装液体制剂进行灭菌处理和真空检漏的先进设备。它采用高温水淋浴方式对液瓶加热和灭菌,具有温度均匀，温度控制范围宽，调控可靠等优点。同时计算机控制可实现F0值自动计算，对灭菌进行监控。灭菌操作结束后，对灭菌室抽真空，充入颜色，对安瓿进行检漏和清洗处理。安瓿水浴灭菌器是目前国际上对安瓿针剂、口服液等瓶装液体制剂进行灭菌处理和真空检漏的先进设备。它采用高温水淋浴方式对液瓶加热和灭菌,具有温度均匀，温度控制范围宽，调控可靠等优点。同时计算机控制可实现F0值自动计算，对灭菌进行监控。灭菌操作结束后，对灭菌室抽真空，充入颜色，对安瓿进行检漏和清洗处理。

2）流通蒸气灭菌 在常压下使用100℃流通蒸气加热杀灭微生物的方法。通常灭菌时间为30min～60min。本法不能保证杀灭所有的芽胞，系非可靠的灭菌法，可适用于消毒及不耐高热的制剂的灭菌。 3）煮沸灭菌法把待灭菌物品放入沸水中加热灭菌的方法。通常煮沸30min～60min。本法灭菌效果差，常用于注射器、注射针等器皿的消毒。必要时加入适当的抑菌剂，如甲酚、氯甲酚、苯酚、三氯叔丁醇等，可杀死芽胞菌。

4）低温间歇灭菌法 将待灭菌的物品，用60℃～80℃水或流通蒸气加热1h，将其中的细胞繁殖体杀死，然后在室温中放置24h，让其中的芽胞发育成为繁殖体，再次加热灭菌、放置，反复进行3～5次，直至消灭芽胞为止。本法适用于不耐高温的制剂的灭菌。缺点是：费时，工效低，且芽胞的灭菌效果往往不理想，必要时加适量的抑菌剂，以提高灭菌效率。美国及英国药典没有收载本法。

2、射线灭菌法 1）辐射灭菌法以放射性同位素（或）放射的γ射线杀菌的方法。射线可使有机化合物的分子直接发生电离，产生破坏正常代谢的自由基，导致微生物体内的大分子化合物分解。辐射灭菌的特点是不升高灭菌产品的温度，穿透性强，适合于不耐热药物的灭菌，现已成功地应用于维生素类、抗生素、激素、肝素、羊肠线、重要制剂、医疗器械、高分子材料等物质的灭菌。包装材料也可灭菌，从而大大减少了污染的机会。

2）紫外线灭菌法 • 紫外线灭菌法是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。一般用于灭菌的紫外线波长是200nm～300nm，灭菌力最强的波长是254nm。 • 紫外线作用于核酸蛋白促使其变性，同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧，从而起共同杀菌作用。紫外线进行直线传播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但较易穿透清洁空气及纯净的水。

3）微波灭菌法 • 用微波照射而产生的热杀灭微生物的方法。所谓微波是指频率在300兆赫到300千兆赫之间的高频电磁波。 • 极性分子在微波电磁场的作用下，按电磁场方向整齐排列，而微波电磁场方向在每秒钟内改变24.5亿次，这些极性分子的排列位置将随电场的改变而急剧改变，分子在快速改变方向的过程中互相撞击、摩擦而产生热，变成宏观的微波加热。水是极性分子，在交变电场的作用下极化并能产生剧烈的转动而发热，因而具有强烈的微波吸收能力。

微波能穿透到介质的深部，通常可使介质表里一致地加热。微波能穿透到介质的深部，通常可使介质表里一致地加热。 • 本法适用于水性注射液的灭菌。据报道，比较微波灭菌与高压蒸气灭菌对17种化学药物稳定性的影响，证明对高压蒸气灭菌稳定的药物，使用微波灭菌无变化；而对高压蒸气灭菌不稳定的药物，如维生素C、阿司匹林等用微波灭菌，则比较稳定，其分解程度降低。

国内开发的微波灭菌机是利用微波的热效应和非热效应（生物效应）相结合，实现了灭菌的目的。其中热效应使细菌体内蛋白质变性，细菌失去活性。非热效应干扰了细菌正常的新陈代谢，破坏细菌生长条件。微波的生物效应起到物理化学灭菌所没有的特殊作用，能在低温（70℃～80℃左右）达灭菌效果。国内开发的微波灭菌机是利用微波的热效应和非热效应（生物效应）相结合，实现了灭菌的目的。其中热效应使细菌体内蛋白质变性，细菌失去活性。非热效应干扰了细菌正常的新陈代谢，破坏细菌生长条件。微波的生物效应起到物理化学灭菌所没有的特殊作用，能在低温（70℃～80℃左右）达灭菌效果。

微波灭菌以低温、常压、省时（灭菌速度快，一般为2min～3min），高效、均匀、保质期长（不破坏药物原有成分，灭菌后的药品存放期可增加1/3以上）、节约能源、不污染环境、操作简单、易维护等优点。我国生产的MMM-6型微波灭菌机，经检验，开机60s，能完全杀灭安瓿内大肠杆菌；开机90s，对安瓿内枯草杆菌黑色变色芽胞灭菌率达99.99%。微波灭菌以低温、常压、省时（灭菌速度快，一般为2min～3min），高效、均匀、保质期长（不破坏药物原有成分，灭菌后的药品存放期可增加1/3以上）、节约能源、不污染环境、操作简单、易维护等优点。我国生产的MMM-6型微波灭菌机，经检验，开机60s，能完全杀灭安瓿内大肠杆菌；开机90s，对安瓿内枯草杆菌黑色变色芽胞灭菌率达99.99%。

3.过滤灭菌法 • 用过滤方法除去活的或死的微生物的方法，是一种机械除菌的方法。这种机械叫除菌过滤器。主要适用于对热不稳定的药物溶液、气体、水等的除菌。 • 供灭菌用的滤器，要求能有效地从溶液中除净微生物，溶液顺畅地由滤器通过，滤液中不落入任何不需要的物质，滤器容易清洗，操作简便。

繁殖型细菌一般＞1μm，芽胞大小≤0.5μm。对于以表面过筛作用截留的除菌滤器，其孔径必须小到足以阻止细菌和芽胞进入滤孔之内，例如纤维素酯膜滤器的筛孔大小约为0.2μm；对于阻留于孔道内或静电作用截留的除菌滤器，其孔径可稍大于所需滤除的菌体，但压力过大或波动，菌体有被挤过的可能。繁殖型细菌一般＞1μm，芽胞大小≤0.5μm。对于以表面过筛作用截留的除菌滤器，其孔径必须小到足以阻止细菌和芽胞进入滤孔之内，例如纤维素酯膜滤器的筛孔大小约为0.2μm；对于阻留于孔道内或静电作用截留的除菌滤器，其孔径可稍大于所需滤除的菌体，但压力过大或波动，菌体有被挤过的可能。 • 最常用测定孔径的方法，是用大小为0.7μm左右的灵菌（B. prodigilsus）混悬液过滤，滤液通过培养实验，观察有无灵菌生长。

灭菌过滤一般选用孔径0.22μm或0.3μm。常用的除菌滤器有G6号垂熔玻璃漏斗、微孔薄膜滤器、孔径在1.3μm以下的白陶土滤柱等。该法应配合无菌操作技术，并对成品必须进行无菌检查，以保证其除菌质量。膜滤器性能参见本章第二节。灭菌过滤一般选用孔径0.22μm或0.3μm。常用的除菌滤器有G6号垂熔玻璃漏斗、微孔薄膜滤器、孔径在1.3μm以下的白陶土滤柱等。该法应配合无菌操作技术，并对成品必须进行无菌检查，以保证其除菌质量。膜滤器性能参见本章第二节。

（四）灭菌参数和灭菌验证 • 1、灭菌参数（F与F0值） • 近年来对灭菌过程和无菌检查中存在的问题已引起人们的关注。在检品中存在微量的微生物时，往往难以用现行的无菌检验法检出。因此，有必要对灭菌方法的可靠性进行验证。F与F0值可作为验证灭菌可靠性的参数。

D值与Z值 • （1）D值 • 研究表明，微生物受高温、辐射、化学药品等作用时就要被杀灭，其杀灭速度符合一级过程，即： • 式中，N0—原有微生物数；Nt—灭菌时间为t时残存的微生物数；k—杀灭速度常数。或

lgNt对t作图得一直线，斜率，令斜率的负倒数为D值，即：lgNt对t作图得一直线，斜率，令斜率的负倒数为D值，即： • 由式可知，当lgN0-lgNt=1时D=t，即D的物理意义为，在一定温度下杀灭微生物90%或残存率为10%时所需的灭菌时间（分）。

（2）Z值 • 灭菌条件不同，其灭菌速率也不同。当温度升高时，速度常数k增大，因而D值（灭菌时间）随温度的升高而减少。在一定温度范围内（100～138℃）lgD与温度T之间呈直线关系。令 • 故Z值为降低一个lgD值所需升高的温度数。即，灭菌时间减少到原来的1/10所需升高的温度。

如Z=10℃，意思是灭菌时间减少到原来灭菌时间的10 %，而具有相同的灭菌效果，所需升高的灭菌温度为10℃。式15-8可以改写为： • 设Z=10℃，T1=110℃，T2=121℃，则D2=0.079D1。即110℃灭菌1 min与121℃灭菌0.079min，其灭菌效果相当。若Z=10℃，灭菌温度每增加一度，则D1=1.259D2，即温度每增加一度，其灭菌速率提高25.9%。

F值与F0值 （3）F值 F值的数学表达式如下： • 式中，△t—测量被灭菌物温度的时间间隔，一般为0.5～1.0分钟；T—每个时间间隔△t所测得被灭菌物温度；T0—参比温度。

根据表达式，F值为在一系列温度T下给定Z值所产生的灭菌效力与在参比温度T0下给定Z值所产生的灭菌效力相同时，T0温度下所相当的灭菌时间，以分为单位。即整个灭菌过程的效果相当于T0温度下F时间的灭菌效果。F值常用于干热灭菌。根据表达式，F值为在一系列温度T下给定Z值所产生的灭菌效力与在参比温度T0下给定Z值所产生的灭菌效力相同时，T0温度下所相当的灭菌时间，以分为单位。即整个灭菌过程的效果相当于T0温度下F时间的灭菌效果。F值常用于干热灭菌。 • 干热灭菌时Z=20℃，参比温度为170℃。评价干热灭菌的相对能力时，必须要保证F值大于60min（170℃），30min（180℃）。破坏大肠杆菌内毒素的F值为250℃时750min。

（4）F0值 • 在湿热灭菌时，参比温度定为121℃，以嗜热脂肪芽孢杆菌作为微生物指示菌，该菌在121℃时，Z值为10℃。则： • 显然，F0值为一定灭菌温度（T），Z为10℃所产生的灭菌效果与121℃，Z值为10℃所产生的灭菌效力相同时所相当的时间（min）。

也就是说，不管温度如何变化，t分钟内的灭菌效果相当于温度在121℃下灭菌F0分钟的效果，即它把所有温度下灭菌效果都转化成121℃下灭菌的等效值。因此称F0为标准灭菌时间（min）。按上式定义的F0又叫物理F0，目前F0应用仅限于热压灭菌。也就是说，不管温度如何变化，t分钟内的灭菌效果相当于温度在121℃下灭菌F0分钟的效果，即它把所有温度下灭菌效果都转化成121℃下灭菌的等效值。因此称F0为标准灭菌时间（min）。按上式定义的F0又叫物理F0，目前F0应用仅限于热压灭菌。 • 灭菌过程中，只需记录被灭菌物的温度与时间，就可算出F0。假设如下数据，△t取一分钟，即每分钟测量一次温度。

表15-3 灭菌过程中不同时间的温度 按表15-3中数据用式15-11计算如下：

计算结果说明44min内一系列温度下的灭菌效果相当与在121℃灭菌8.49分钟的灭菌效果。计算结果说明44min内一系列温度下的灭菌效果相当与在121℃灭菌8.49分钟的灭菌效果。 • F0值的计算要求测定灭菌物品内部的实际温度，并将不同温度与时间对灭菌的效果统一在121℃湿热灭菌的灭菌效力，它包括了灭菌过程中升温、恒温、冷却三部分热能对微生物的总致死效果。故F0值可作为灭菌过程的比较参数，对于灭菌过程的设计及验证灭菌效果具有重要意义。说明一点，F0值仅是用时间单位表示量值，并不是“时间”的量值。

将式（15-11）编入计算机程序中，将计算机与灭菌器连接，根据测得数据，就可自动显示F0值。F0值随温度变化而呈指数变化，因此温度即使有很小的差别（如0.1～1.0℃），将对F0值产生显著影响。为了使F0测定准确，应选择灵敏度高、重现性好、精密度为0.1℃的热电偶，灭菌时应将热电偶的探针置于被测物的内部，经灭菌器通向温度记录仪。将式（15-11）编入计算机程序中，将计算机与灭菌器连接，根据测得数据，就可自动显示F0值。F0值随温度变化而呈指数变化，因此温度即使有很小的差别（如0.1～1.0℃），将对F0值产生显著影响。为了使F0测定准确，应选择灵敏度高、重现性好、精密度为0.1℃的热电偶，灭菌时应将热电偶的探针置于被测物的内部，经灭菌器通向温度记录仪。 • 对灭菌工艺及灭菌器进行验证，要求灭菌器内热分布均匀一致，重现性好。

F0值的影响因素主要有：①容器大小、形状、热穿透系数；②灭菌产品溶液粘度、容器充填量；③容器在灭菌器内的数量与排布等。F0值的影响因素主要有：①容器大小、形状、热穿透系数；②灭菌产品溶液粘度、容器充填量；③容器在灭菌器内的数量与排布等。 • F0值是121℃时微生物降解所需时间，参考式15-7，F0值等于D121值与微生物的对数降低值的乘积。由于F0由微生物的D值和微生物的初始数及残存数所决定，所以F0又叫生物F0。

式中，Nt为灭菌后预期达到的微生物残存数。又叫染菌度概率（Probability of nonsterility）一般取Nt为10-6（原有菌数的百万分之一，或100万个制品中只允许有一个制品染菌）即认为达到可靠的灭菌效果。比如，将含有200个嗜热脂肪芽胞杆菌的5%葡萄糖水溶液以121℃热压灭菌时，其D值为2.4min。则 • 因此，F0值也可认为是相当于121℃热压灭菌时杀死容器中全部微生物所需要的时间。

为了保证F0值的灭菌效果，应注意以下两个问题。为了保证F0值的灭菌效果，应注意以下两个问题。 ①根据式15-12，若N0越大，即被灭菌物中微生物数越多，则灭菌时间越长，故尽可能减少各工序中微生物对药品的污染，分装好的药品应尽快灭菌，以使初始微生物数在最低水平。最好使每个容器的含菌量控制在10以下（即lgN0≤1）； ②应适当考虑增强安全因素，一般增加50%。如规定F0为8min，则实际操作应控制F0为12 min为好。

四、化学灭菌法 • 化学灭菌法是用化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法。化学杀菌剂不能杀死芽胞，仅对繁殖体有效。 • 化学杀菌剂的效果依赖于微生物种类及数目，物体表面的光滑度或多孔性以及杀菌剂的性质。化学杀菌的目的在于减少微生物的数目，以控制无菌状况至一定水平。

1．气体灭菌法 • 利用环氧乙烷等杀菌性气体进行杀菌的方法。可应用于粉末注射剂、不耐热的医用器具、设施、设备等。常用甲醛蒸气、丙二醇蒸气、三甘醇、过氧醋酸蒸气进行操作室内的灭菌。 • 采用该法灭菌时应注意杀菌气体对物品质量的损害以及灭菌后的残留气体的处理。

环氧乙烷灭菌器是在一定的温度、压力和湿度条件下，用环氧乙烷灭菌气体对封闭在灭菌室内的物品进行熏蒸灭菌的专用设备。我国已有环氧乙烷灭菌器的系列产品。环氧乙烷灭菌器是在一定的温度、压力和湿度条件下，用环氧乙烷灭菌气体对封闭在灭菌室内的物品进行熏蒸灭菌的专用设备。我国已有环氧乙烷灭菌器的系列产品。 • 环氧乙烷气体灭菌的主要特点是穿透力强，杀菌广谱，灭菌彻底，对物品无腐蚀无损害等。 • 灭菌器的结构主要由灭菌室、真空装置、加温及热循环装置、加湿装置、气化装置、气动装置、特殊密封装置、残气处理装置以及相应的控制系统组成。

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