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生物技术制药 Biotechnological Pharmaceutics

生物技术制药 Biotechnological Pharmaceutics. 一、课程内容. 第一章 绪论 第二章 基因工程制药 第三章 动物细胞工程制药 第四章 抗体制药 第五章 植物细胞工程制药 第六章 酶工程制药 第七章 发酵工程制药. Chapter 1 绪 论. 第一节 生物技术的发展史. 一、生物技术（ biotechnology ）.

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生物技术制药 Biotechnological Pharmaceutics

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  1. 生物技术制药Biotechnological Pharmaceutics

  2. 一、课程内容 • 第一章 绪论 • 第二章 基因工程制药 • 第三章 动物细胞工程制药 • 第四章 抗体制药 • 第五章 植物细胞工程制药 • 第六章 酶工程制药 • 第七章 发酵工程制药

  3. Chapter 1 绪 论

  4. 第一节 生物技术的发展史 一、生物技术（biotechnology） 生物技术：以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（或品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。 包括 基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、生化工程以及后来衍生出来的第二代、第三代的蛋白质工程、抗体工程、糖链工程和海洋生物技术等。

  5. 生物技术的优越性 ⑴ 不可取代性（育种、制药） ⑵ 快速、精确（单克隆抗体检测妊娠） ⑶ 低耗、高效（生物酶催化：化学催化） ⑷ 副产物少、副作用小、安全性好 ⑸ 高附加值性 ⑹ 符合生态型的经济技术发展体系

  6. 现代生物技术的基础学科和分支 • 分子生物学 • 微生物学 • 生物化学 • 遗传学　　 • 细胞生物学 • 化学工程 医药生物技术 现代生物技术 生物技术疫苗 生物技术诊断 农业生物技术 家畜生物技术 海洋生物技术

  7. 二、生物技术发展简史 • 传统生物技术的技术特征是酿造技术 • 公元前6000年古代巴比伦人酿造啤酒 • 公元前4000年埃及人发酵面包 • 我国 殷朝 制酱 • 周朝 制醋 • 特点:自然发酵、全凭经验 • １传统生物技术阶段

  8. ２近代生物技术阶段 • 近代生物技术的技术特征是微生物发酵技术 • 1674年荷兰布商列文虎克自制了高倍显微镜(300倍左右)观察到了微生物。 • 1865年法国科学家巴斯德证明了发酵原理。 • 1928年英国 Fleming发现青霉素 • 1940年英国弗洛里、钱恩分离出青霉素

  9. 近代生物技术时期的特点： 1. 产品类型多初级（氨基酸、酶、有机酸）；次级（抗生素）；生物转化（甾体） 等； 2. 生物技术要求高（纯种、无菌、通气、产品质量要求也高）； 3. 生产设备规模巨大500立方米，2000立方米； 4. 技术发展速度快。 青霉素初期发酵效价为200 U/ml,现在为80000 U/ml。

  10. ３现代生物技术 • 现代生物技术的技术特征就是以基因工程为首要标志 • 1953年 Watson 、Crick提出DNA双螺旋结构 • 1973年 建立DNA重组技术（Boyer&Cohen，美国） • 1975年 建立单克隆抗体技术（杂交瘤细胞） • 1978年 大肠杆菌表达出胰岛素 • 1997年 英国克隆多利羊

  11. 现代生物技术包括: • ⑴ 重组DNA技术 • ⑵ 细胞和原生质体融合技术 • ⑶ 酶和细胞的固定化技术 • ⑷ 植物脱毒和快速繁殖技术 • ⑸ 动物和植物细胞的大量培养技术 • ⑹ 动物胚胎工程技术

  12. ⑺ 现代微生物发酵技术 • ⑻ 现代生物反应工程和分离工程技术 • ⑼ 蛋白质工程技术 • ⑽ 海洋生物技术

  13. 不能忘记的人 1953年4月25日，英国《自然》杂志发表了沃森和克立克的文章“核酸的分子结构 — DNA的一个结构模型”。标志着DNA双螺旋结构的建立，从此，遗传学和生物学的历史从细胞阶段进入了分子阶段。 J D Watson F H C Crick

  14. 不能忘记的人 Sanger （英国化学家）最早测定胰岛素的氨基酸顺序获得1958年诺贝尔化奖。22年后，他因测定了一种噬菌体的一级结构获1980年的诺贝尔化学奖。 Gilbert 在DNA测序领域，因其卓越的工作获得1980年诺贝尔化学奖。 F Sanger W Gilbert

  15. 不能忘记的人 Berg（美国生物化学家）通过把两个不同来源的DNA连结在一起并发挥其应有的生物学功能，证明了完全可以在体外对基因进行操作。他作为“重组DNA技术之父”于1980年获诺贝尔化奖。 Paul Berg

  16. 不能忘记的人 1985年穆利斯发明了高效复制DNA片段的聚和酶链式反应（PCR）技术，利用该技术可从极其微量的样品中大量生产DNA分子，使基因工程获得了革命性发展。 Kary B Mullis

  17. 第二节 生物技术药物 采用现代生物技术，按照人的设想，借助动植物微生物来生产所需的医药品。 生物技术制药： 生物技术药物： 生物药物： 一般来说,采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。 生物技术药物、生化药物、微生物药物、海洋药物、生物制品的统称。

  18. 生物技术药物分类 • 重组蛋白质药物 • 治疗性抗体药物 • 核酸药物 干扰素、生长激素、胰岛素、集落刺激因子等 Panorex单抗用于结肠直肠炎治疗 Zenapax用于治疗急性肾移植排斥反应 反义核酸、核酶、脱氧核酶、抗基因寡核苷酸、裸DNA疫苗与基因药物

  19. 生物技术药物的特性 • 1.分子结构复杂 • 2.具有种属特异性 • 3.治疗针对性强、疗效高 • 4.稳定性差 • 5.基因稳定性 • 6.免疫原性 • 7.体内的半衰期短 • 8.受体效应 • 9.多效性和网络性效应 • 10.检验的特殊性

  20. 第三节 生物技术制药 一、生物技术制药的特征 • 高技术 • 高知识层次的人才和高新的技术手段 • 高投入 • 一个新的生物医药的平均费用为1～3亿美元，有的高达6亿。 • 高风险 • 成功率为5%－10%，研制时间却需8－10年。 • 高收益 • 利润率回报可高达10倍,上市后2－3便可收回投资。

  21. 二、生物技术在制药中的应用 • 1.基因工程制药 • （1）基因工程药物品种的开发 生长激素抑制素 1 mg 传统法：10万只羊的下丘脑，现：10 L大肠杆菌培养液，0.3美元/mg • （2）基因工程疫苗 • （3）基因工程抗体 • （4）基因诊断与基因治疗

  22. （5）应用基因工程技术建立新药的筛选模型 • （6）应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物 • （7）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用 • 将血红蛋白基因克隆进菌种后可提高菌种对缺氧环境的耐受力。 • （8）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物 • 人体蛋白AAT 10万美元/g，转基因羊羊奶中20 g/L

  23. 2.细胞工程制药 • （1）单克隆抗体技术 • （2）动物细胞培养 • （3）植物细胞培养生产次生代谢产物 • 3.酶工程制药 • 4.发酵工程制药 • 工艺改进、新药研制和菌种改造

  24. 三、我国生物技术制药现状和发展前景 • 开始于20世纪70年代初，先是进行固定化酶的研究，以后固定化酶和固定化细胞的研究与应用得到发展。 • 70年代后期，开始跟踪国外基因工程技术的某些基础性工作。 • 80年代初期，开始乙型肝炎基因工程疫苗、基因工程干扰素的研究，生物技术方面的项目得到了国家的支持，其中-1b型干扰素为我国首创。

  25. 目前我国生物制药技术申报貌似“活跃”，实际上都是在围绕仅有的几个老品种进行改进或改制，完全创新技术很少。目前我国生物制药技术申报貌似“活跃”，实际上都是在围绕仅有的几个老品种进行改进或改制，完全创新技术很少。 • 与发达国家相比，我国生物技术实验室技术差距不大，但在产业化方面与世界的差距正在逐渐加大：当今世界有20多种畅销生物药时，我国能生产10种；而现在世界上有140多种时，我国却只能生产20多种 。 • 由于我国医药生物技术成果缺乏自主知识产权，而目前我国生物制药公司中技术和产业发展比较成熟的也仅有北京天坛生物、深圳康泰生物、深圳科兴、长春金赛等少数几家企业，产业规模较小；而一些传统型的制药企业由于受技术条件等影响而难以迅速进入生物制药领域。

  26. 医药生物技术发展展望 • 21世纪是医药生物技术快速发展的时期, 生物制药、化学药物、中药形成三足鼎立,有效的为人类健康服务。 • 1.利用新发现的人类基因开发新型药物。 人类基因组计划已完成。 • 1986年美国科学家达尔贝科提出的人类基因组计划，1990年启动该计划。23对染色体30亿对碱基，3.5万个基因进行测序。 • 美国承担54%，英33%，日7%，法2.8%,德2.2%,中国1%。 • 1999年中国加入人类基因组计划，投资3亿元，负责测定3号染色体3000万对碱基，2000年4月完成。

  27. 2.新型疫苗的研制 艾滋病疫苗和基因型癌疫苗等。 • 3.基因工程活性肽的生产 基因药物:淋巴因子、生长因子、激素和酶 • 4.其它医药业将得到不断改造和发展 转基因药材（利用转基因的烟草来生产人造血浆将成为现实）

  28. 5.新型生物反应器和新型生物技术不断出现 • 新型生物反应器有: 气升式生物反应器 流化床式生物反应器 固定床式生物反应器 袋式或膜式生物反应器 中空纤维生物反应器等。

  29. 四、我国的医药生物技术 已上市的基因工程药物和疫苗 • 1995年 白细胞介素-2 • 1996年 α1b-干扰素α2a-干扰素 α2b-干扰素 • 1997年 粒细胞集落因子 红细胞生成素 • 1992年 乙型肝炎疫苗

  30. 作业： 1、生物技术制药的概念。 2、生物技术药物分为哪些类型？ 3、生物技术制药有哪些特征？

  31. Chapter 2 基因工程制药

  32. 用途：主要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。用途：主要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。 • 获取方式：生化提取 基因工程表达 成本低产量高 活性强性质优 成本高产量低 质量难以保证 • 实例：人生长激素（侏儒症） = 50具新鲜尸体 脑下垂体中提取 采用基因工程从 1～2升细菌培养液中提取获得

  33. 国际生物医药产业发展动态 • 1982 年世界上第一个基因工程药物 ― 重组人胰岛素获准生产销售，至今已有 100 多个生物技术药物上市; • 促红细胞生成素（EPO）以全球销售额 38 亿美元的业绩，居全球最畅销 10 种药物的第6名； • 美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物技术药物研发榜首,其 2002 年产值和销售额已超过 200 亿美元; • 1989 年我国第一个拥有自主知识产权的基因工程药物 -- 重组人干扰素（IFN–α1b）上市以来，目前，世界上销售额排前 10 位的生物技术药物我国已能生产 8 种。

  34. 第一节 概 述 • 生物技术的核心就是基因工程，20世纪70年代基因工程诞生,最先应用在医药科学领域。 • 传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。 • （如：生长激素抑制素 1 mg 传统法：10万只羊的下丘脑，现：10 L大肠杆菌培养液，0.3美元/mg；尿激酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取。

  35. 应用基因工程技术可十分方便且有效地解决传统生物制药所遇到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。应用基因工程技术可十分方便且有效地解决传统生物制药所遇到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。 • 如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。

  36. 利用基因工程技术生产药品的优点： • （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障； • （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； • （3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；

  37. 利用基因工程技术生产药品的优点： • （4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素-2的半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高； • （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

  38. 第二节 基因工程药物生产的过程 基因工程技术是将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌(或细胞），内进行复制和表达的技术。

  39. 基因工程药物生产的上游和下游 • 上游阶段：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成； • 下游阶段：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。

  40. 基因工程药物制备的一般过程 构建基因工程 菌或细胞 获得目的基因 组建重组质粒 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装

  41. 基因工程基本过程 切 接 转 增 检

  42. 工程菌（或细胞）构建中重要的工具 • 工具：酶 • 限制性内切酶 • 连接酶 • 逆转录酶 • Klenow 酶大片段（DNA聚合酶 I） • 核酸酶S1

  43. 第三节 目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。（不能直接分离？） 一、逆转录法 • 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 • cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。

  44. 逆转录法的步骤 • 1、mRNA的纯化 • 2、cDNA第一链的合成 • 3、cDNA第二链的合成 • 4、cDNA克隆 • 5、将重组体导入宿主细胞 • 6、cDNA文库的鉴定 • 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定

  45. DNA聚合酶I Klenow片段 cDNA克隆示意图 mRNA 逆转录酶 ss-DNA ds-cDNA 核酸酶S1 ds-cDNA

  46. 1、mRNA的纯化 • 真核细胞 mRNA 3’-polyA （20～250) • 采用Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。 2、cDNA第一链的合成 可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。

  47. 3、cDNA第二链的合成 • 除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链(碱解或RNaseH酶解) • 然后以cDNA第一链为模板合成第二链。由于第一链cDNA链3’-末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链(常用Klenow酶或DNA聚合酶I) • 切除发夹结构（核酸酶S1，专一性切除单链DNA）

  48. 4、cDNA克隆 • 用于cDNA克隆的载体有三类： 细菌质粒（如pBR322、 pUC等）插入片段<10kb 噬菌体（如gt10、 gt11等） >10kb 动植物病毒 • 根据重组后插入的cDNA能否经转录和翻译合成蛋白质 非表达型载体（pBR322及gt10 ） 表达型载体（pUC及gt11 ）有利于目的基因的筛选

  49. 5、将重组体导入宿主细胞 1、转化：指质粒DNA 或以它为载体构建的重组DNA 导入细菌的过程。 2、转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 脂质体介导： 原生质体融合： 电穿孔： 显微注射： 基因枪： 病毒介导： 农杆菌转染：

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