Mikrobioloģija + molekulārā bioloģija

1. Mikrobioloģija + molekulārā bioloģija Kārtu sagatavoja Juris Ķibilds un Kārlis Vilks Kārtu pasniedz Kārlis Vilks 12.10.2013.

2. Vispārīgi par šo kārtu • Šajā kārtā apskatīsim mirkobioloģijas un molekulārās bioloģijas metodes darbā ar proteīniem • Varēsiet nopelnīt … punktus • Katrā jautājumā no vienas līdz visām pareizajām atbildēm • Par nepareizajām atbildēm punkti nost!

3. Der zināt • Proteīni jeb olbaltumvielas ir viena no dzīvībai svarīgākajām ķīmisko savienojumu grupām • Tie ir aminoskābju polimēri (jeb garas un dažnedažādi salocītas molekulas) • Tie pilda dažādas funkcijas: • Strukturālie proteīni • Enzīmi (ķīmisko reakciju katalizatori) • Transporta proteīni • Hormoni, signālmolekulas • Antivielas (imunitāte) • Un citas funkcijas

4. 1. Kuros no šiem jūsu ķermenī notiekošajiem procesiem darbojas proteīni? • Muskuļu kustības • Kotletes sagremošana • Vakardienas ballītē izdzertā alus vai apelsīnu sulas pārstrāde • Redze • Domāšana par bioloģiju

5. 2. Vieta pašizpausmei • Mēs gribam pētnieciskiem vai rūpnieciskiem mērķiem pavairot kādu cilvēka organismā sastopamu proteīnu • Kurš proteīns tas būs? • Kāpēc būtu svarīgi to pētīt vai ražot?

6. 3. • Lai sintezētu vajadzīgo proteīnu, mūsu darbā būs šādi posmi: • Kultivēt rekombinantās baktērijas • Ievietot DNS baktērijā • Izdalīt un attīrīt vajadzīgo proteīnu • Iegūt proteīnu kodējošo DNS sekvenci • Sarindojiet tos pareizā darba veikšanas secībā!

7. 4. • Molekulārās bioloģijas centrālā dogma parāda ģenētiskās informācijas plūsmu bioloģiskās sistēmās  • Kā mēs noskaidrosim vajadzīgo proteīnu kodējošo DNS sekvenci? • No aminoskābju secības proteīnā • Mēģinātu atrast attiecīgo mRNS, tad cDNS un visbeidzot pašu DNS • Sameklētu datu bāzē internetā • Izzīstu no pirksta

8. 5. • Kad būs noskaidrota vajadzīgā DNS sekvence, jāiegūst pati DNS. Kā būtu visprātīgāk to izdarīt? • Dosimies uz slimnīcu un palūgsim ķirurgiem audu atgriezumus, no kā izdalīsim DNS • Izdalīsim paši no sevis un saviem draugiem • Centīsimies paši uzsintezēt • Pasūtīsim kādai firmai, kas sintezēs un piegādās mums vajadzīgo DNS

9. Der zināt • Populārs organisms rekombinato proteīnu sintēzei ir zarnu nūjiņa Escherichia coli (tās ir lēti un vienkārši kultivēt). • Papildus hromosomai baktērijām ir arī mazākas gredzenveida DNS molekulas jeb plazmīdas. • Plazmīdas var modificēt (ievietot vai izgriezt mums vajadzīgos gēnus) un mākslīgi ievietot baktērijās vai rauga šūnās, tādējādi piešķirot tām mums interesējošās īpašības

10. Der zināt • Plazmīdas ir baktēriju genoma elementi, kas baktērijām palīdz izdzīvot skarbajā pasaulē • Ar plazmīdu palīdzību baktērijas var iegūt dažādas spējas: rezistenci pret antibiotikām, noārdīt dažādus savienojumus, inficēt organismus, sintezēt antibiotikas pret citām baktērijām, utt. • Plazmīdas var izmantot, lai liktu baktērijām darīt to, ko mēs gribam, piemēram sintezēt rekombinantus proteīnus

11. Šis tas par plazmīdām • Parasti baktērijām ir 2-3 plazmīdas, bet ir arī izņēmumi

12. Komerciāli lietojamās plazmīdas shēma

13. pUC19 plazmīda Bultiņas parāda gēnus Svītriņas uz apļa restrikcijs enzīmu šķelšanai saitus un enzīmu nosaukmus

14. Tā izskatās plazmīda, kurā esam ievietojuši sev interesējušo gēnu Proteīns AmpicRez

15. 6. • Kāpēc plazmīdā ievietots Ampicīlīna rezistences gēns? • Ražotāju kļūda, ko viņiem kauns novērst • Ampicilīna rezistence pasargā plazmīdu, no noārdīšanās • Baktēriju barotnei plānots pievienot ampicilīnu • Ampicilīna rezistence pasargā baktēriju no antibiotikas iedarbības

16. 7. • Pēc plazmīdu ievietošanas plates ar uzsētajām zarnu nūjiņām liksim termostatā uz vienu dienu. Bet kādā temperatūrā? • 20 0C • 25 0C • 32 0C • 37 0C • 40 0C

17. 8. • Lai tiktu pie kārotā proteīna, vispirms jāsagrauj šūnas. Ar kurām metodēm to var izdarīt? • Ar ultraskaņu • Samalt ar stikla lodītēm • Ķīmiski noārdīt ar proteināzi • Ķīmiski noārdīt ar lipāzi • Ķīmiski noārdīt ar Dnāzi • Ar radiāciju

18. Ni2+ afinitātes hromotogrāfija • Mūsu vajadzīgajam proteīnam bija pievienota poli Histidīna aste, lai varētu attīrīt proteīnu izmantojot Niķeļa affinitātes hromatogrāfiju. Histidīna molekulas piesaistīsies pie Niķeļa joniem, tādējādi mūsu proteīns paliks kolonnā, pārējie izies kolonnai cauri.

19. Niķeļa afinitātes hromatogrāfija

20. 9. • Kā proteīnu dabūt ārā no kolonnas? • Ieliet kolonnā savienojumu, kas saistās ar Ni2+ labāk par histidīnu! Kurš no savienojumiem šeit derēs labāk? • A – Ūdens • B – Benzols • C- Imidazols • D- Entanols Histidīns

21. 10. • Esam izvēlējušies visus savienojumus! Sastādām darba gaitu: • A- Atdalām nepieciešamo proteīnu no Niķeļa • B- Mērām proteīnu koncentrāciju savāktajās frakcijās • C- Skalojam kolonnu no piemaisījumiem • D- Uzstāda afinitātes kolonnu • E –Izlaižam caur kolonnu šūnu lizātu

22. 11. B – Skalošana C – Pētāmā proteīna atdalīšana A - Šūnu lizāta pievienošana • Atzīmējiet grafikā, kas notiek konkrētajā brīdī! 1

23. Apsveicam! • Esam ieguvuši mums vajadzīgo proteīnu! • Tagad nododam lapiņas!

24. 1. Kuros no šiem jūsu ķermenī notiekošajiem procesiem darbojas proteīni? • Muskuļu kustības • Kotletes sagremošana • Vakardienas ballītē izdzertā alus vai apelsīnu sulas pārstrāde • Redze • Domāšana par bioloģiju

25. 2. Pētāmais proteīns • Der jebkurš eksistējošs proteīns, ar pietiekoši pamatotu apgalvojumu, kāpēc tas būtu jāpēta. Vai arī!

27. 3. • Lai pavairotu vajadzīgo proteīnu, mūsu darbā būs šādi posmi: • Iegūt proteīnu kodējošo DNS sekvenci • Ievietot DNS baktērijā • Kultivēt rekombinantās baktērijas • Izdalīt un attīrīt vajadzīgo proteīnu

28. 4. • Molekulārās bioloģijas centrālā dogma parāda ģenētiskās informācijas plūsmu bioloģiskās sistēmās  • Kā mēs noskaidrosim vajadzīgo proteīnu kodējošo DNS sekvenci? • No aminoskābju secības proteīnā • Mēģinātu atrast attiecīgo mRNS, tad cDNS un visbeidzot pašu DNS • Sameklētu datu bāzē internetā • Izzīstu no pirksta

29. 5. • Kad būs noskaidrota vajadzīgā DNS sekvence, jāiegūst pati DNS. Kā būtu visprātīgāk to izdarīt? • Dosimies uz slimnīcu un palūgsim ķirurgiem audu atgriezumus, no kā izdalīsim DNS • Izdalīsim paši no sevis un saviem draugiem • Centīsimies paši uzsintezēt • Pasūtīsim kādai firmai, kas sintezēs un piegādās mums vajadzīgo DNS

30. 6. • Kāpēc plazmīdā ievietots Ampicīlīna rezistences gēns? • Ražotāju kļūda, ko viņiem kauns novērst • Ampicilīna rezistence pasargā plazmīdu, no noārdīšanās • Baktēriju barotnei plānots pievienot ampicilīnu • Ampicilīna rezistence pasargā baktēriju no antibiotikas iedarbības

31. 7. • Pēc plazmīdu ievietošanas plates ar uzsētajām zarnu nūjiņām liksim termostatā uz vienu dienu. Bet kādā temperatūrā? • 20 0C • 25 0C • 32 0C • 37 0C • 40 0C

32. 8. • Lai tiktu pie kārotā proteīna, vispirms jāsagrauj šūnas. Ar kurām metodēm to var izdarīt? • Ar ultraskaņu • Samalt ar stikla lodītēm • Ķīmiski noārdīt ar proteināzi • Ķīmiski noārdīt ar lipāzi • Ķīmiski noārdīt ar Dnāzi • Ar radiāciju

33. 9. • Kā proteīnu dabūt ārā no kolonnas? • Ieliet kolonnā savienojumu, kas saistās ar Ni2+ labāk par histidīnu! Kurš no savienojumiem šeit derēs labāk? • A – Ūdens • B – Benzols • C- Imidazols • D- Entanols Histidīns

34. 10. • Esam izvēlējušies visus savienojumus! Sastādām darba gaitu: • D- Uzstāda afinitātes kolonnu • E –Izlaižam caur kolonnu šūnu lizātu • C- Skalojam kolonnu no piemaisījumiem • A- Atdalām nepieciešamo proteīnu no Niķeļa • B- Mērām proteīnu koncentrāciju savāktajās frakcijās

35. 11. 1 - Šūnu lizāta pievienošana 2- Skalošana 3– Pētāmā proteīna atdalīšana • Atzīmējiet grafikā, kas notiek konkrētajā brīdī! 1

36. Paldies par uzmanību!