Dipresentasikan : WIJIYONO Mikrobiologi Mahasiswa Sekolah Pasca Sarjana Universitas Sumatera Utara

1. STATUS PERKEMBANGAN PERBAIKAN SIFAT GENETIK PADI MENGGUNAKAN TRANSFORMASI AGROBACTERIUMSyamsidah RahmawatiPusat Penelitian LIPI, jl. Raya Bogor Km 46, Cibinong Dipresentasikan : WIJIYONO Mikrobiologi Mahasiswa Sekolah Pasca Sarjana Universitas Sumatera Utara

2. Latar belakang Produktivitas beras rendah Tidak seimbang antara produksi beras dengankonsumen Produks gen: -nutrisi padi (golden rice) -tahan kering Perbaikan genetik padi Dengan menggunakan Agrobacterium tumifacien Terobosan baru • Tehnik transfer gen langsung • Tehnik transfer gen Secara tak langsung Peran mikroba tanah

3. Bakteri Agrobacterium tumifacien • Kemampuan menstranfer potongan DNA (T-DNA) ke genom tanaman • Komponen genetik Gen virulen kromosom (kromosomal virulence (chv) Kelompok gen virulen (vir) yang terdapat pada plasmid Ti • Daerah T-DNA dibatasi : LB (left border), RB (right border yang merupakan gen Bakteri • Gen T-DNA : Gen ia aH, gen ia aM, dan ipt enzim

4. Mekanisme integrasi T-DNA dalam genom Tanaman(Inland (1996), Sheng dan Citovsky (1996), de la Riva et al.(1998)

5. Hoekema et al (1984) T-DNA dapat ditransfer meskipun terletak pada plasmid yang berbeda (plasmid ganda) binnary vektor.

6. Faktor yang mempengaruhi transformasi Agrobacterium • Genotip dan jaringan tanaman/eksplan (Azhakanandam et al (2000) : keberhasilan transformasi agrobacterium sangat tergantung pada genotip tanaman. Jaringan yang baik : jaringan yang memberikan respon yang baik terhadap kultur jaringan.

7. Strain Agrobacterium dan Plasmid/vektor Adanya penggunaan A. tumifaciens strain biasa (LBA) 4404) dikombinasikan dengan vektor super biner dengan gen ekstra gen virB, C dan G sangat efektif untuk menstranfer padi.

8. Strain Agrobacterium dan Plasmid/vektor - Adanya penggunaan A. tumifaciens strain biassa (LBA) 4404) dikombinasikan dengan vektor super biner dengan gen ekstra gen virB, C dan G sangat efektif untuk menstranfer padi. • Berpengaruh terhadap efisiensi transformasi • Kelemahannya terbatas pada inang yang diinfeksi

9. Asetosiringon dan Ph • Senyawa fenolik yang berperanan dalam mekanisme transfer gen • Kondisi Ph berpengaruh terhadap gen vir. Gen vir dapat diekspresiksn pada pH 5 -8 . • Ph 5,2 adalah Ph yang paling baik untuk digunakan dalam transfer genetik.

10. Antibiotik untuk eliminasi Agrobakterium • Setelah diko-kultivasi kalus direndam dalam larutan antibiotik : untuk menghindari berkembangnya bakteri Agrobakterium • Dilanjutkan penggunaan antibiotik pada media regenerasi ( Yara et al.2001 )

11. Kondisi infeksi dan kokultur • Bakteri yang digunakan untuk infeksi sel tanaman adalah bakteri yang sedang tumbuh aktif ( fase logaritma ) • Sebelum inokulasi bakteri ditumbuhkan pada media yang mengandung asetosiringon

12. Media induksi, Ko-kultivasi, regenerasi • Media induksi N6 sedangkan media regenerasi adalah MS ( hiei et al.1994;Rashid et al.1996;Toki 1997; Yara et al. 2001; cao et al.2004). • Toki 1997 : Penambahan casamino acids dan prolin dapat meningkatkan kemampuan regenerasi tanaman dan dapat menghasilkan tanaman trasgenik dalam waktu 2 bulan sejak induksi.

13. Bahan Penyeleksi • Higromisin(hpt), fostinotrisin (bar) (Hiei et al.1994;rashid et al. 2003; Saharan et al. 2004; Jin et al, 2004). • Kanamisin (nptII) atau G418 tapi penggunaannya sangat terbatas karena dapat menghambat pertumbuhan sel ( Azhakanandam et al. 2000)

14. Ekspresi dan Stabilitas Gen • Penyisipan gen ke genom tanaman harus dapat diekspresikan. • Espresikan gen dapat ditingkatkan dengan penambahan enhancer dikombinasikan dengan penggunaan promoter yang kuat atau promoter spesifik.

15. Stabilitas Gen • Gen yang telah terintegrasi pada genom tanaman, maka gen tersebut akan stabil diwariskan ke generasi berikutnya. • Hiei dan Komari (1996) melaporkan trasgen stabil diwariskan hingga generasi ke 4. • Wu et al.(2002) melaporkan trasgen stabil diwariskan hingga generasi ke 6. • Rashid et al (1996) melaporkan kegagalan mengekspresikan gen disebabkan karena ada pebungkaman gen.

16. Prospek • Tanaman padi yang mengandung gen : Tahan penggerek batang Penyakit blas Hawar daun Kekeringan, salinitas dan herbisida • Tanaman padi dengan daya hasil tinggi, kandungan zat besi dan vitamin A yang tinggi

17. Tabel1. Beberapa gen yang telah diintroduksi ke dalam tanaman menggunakan transformasi Agrobacterium

18. Kesimpulan • Transformasi agrobacterium telah berhasl dilakukan pada berbagai kultivar padi japonica, indica dan javanica • Keberhasilan trasformasi ditentukan oleh :pemilihan genotip, jaringan tanaman, umur eksplan, strain agrobacterium, vektor, konsentrasi asetosiringon dan Ph, kerapatan sel bakteri, lama dan suhu kokultivasi, antibiotik, bahan penyeleksi, komposisi media kultur .

19. Peningkatan efisiensi transformasi disebabkan : penggunaan asetosiringon dan bahan pemadat yang tinggi, pengeringan kalus secara perlahan atau penambahan antinekrotik pasca ko kultivasi . • Peningkatan ekspresi gen : pemilihan promoter, penggunaan kodon yang sesuai, penambahan enhancer • Gen tunggal dan poligenik telah berhasil diintroduksikan ke dalam tanaman padi dalam upaya perbaikan mutu genetik padi • Kemampuan transformasi Agrobakterium menghasilkan tanaman transgenik dengan salinan tunggal.