La reacción de PCR y sus aplicaciones

1. La reacción de PCR y sus aplicaciones

2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

3. primers DNA producto nº ciclos PCR: cinética

4. Desnaturalización: Lo mas corto posible Evita inactivación enzima Anillamiento: Lo mas cerca posible de las Tm de los primers Extensión: Lo mas extenso posible para asegurar fragmentos completos PCR: diseñando ciclos 92ºC 92ºC 92ºC 72ºC 72ºC 72ºC 55ºC 55ºC 55ºC RT

5. primers DNA producto Enzyme activity nº ciclos PCR: cinética

6. DNA polimerasas termoestables • Procesividad: 5’-3’ actividad de síntesis • Fidelidad: 3’-5’ exonucleasa • Adición de As

7. Procesividad 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Tiempo de extensión: Taq polimerasa: 2 Kb/min Pfu polimerasa: 0.5 Kb/ min Pwo polimerasa: 1 Kb/min

8. Fidelidad en la PCR 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’-5’ exo Tasa de error % productos con mutación Polimerasa Taq polimerasa NO 8.0x10-6 16.0 Pfu polimerasa SI 1.3x10-6 2.6 Pwo polimerasa SI 0.4x10-6 0.7

9. -T3’ 3’T- A T -T A Adición de As -A3’ 5’ -A3’ 3’A- 5’ Adición de As: Taq polimerasa: SI Pfu polimerasa: NO Pwo polimerasa: NO

10. Optimización de PCR • Parametros del ciclo • Minimo numero de ciclos • Las tres reglas • Diseño de oligos • Tm’s 55-80ºC • No concentrar GC en el extremo 3’ • Concentración de Mg2+ (0.5-3 mM) • Demasiado da inespecificidad • Poco da poca producción • Coadyuvantes • BSA: estabiliza la polimerasa y secuestra inhibidores no especificos • Formamida: Baja la temperatura de desnaturalización (moldes ricos en GC) • DMSO: Ayuda la elongación en moldes ricos en GC • Mezcla de polimerasas • Hot start

11. Algunas aplicaciones • Obtener genes • PCR degenerada • PCR reversa • Modificar genes • Introducir sitios de restricción • Mutagénesis dirigida • Mutagénesis al azar

12. ADRGT YKILP 5’ACNGCYTGNTGRCGN3’ 5’NTTNCAYGARTCYTT3’ • PCR en condiciones poco estrictas • Temperatura • Mg++ • Concentracion de oligos • Diseño de los primers: • Tamaño minimo (21 mer) • Evitar aminoacidos con mas de un tipo de codon • No mas de tres G o C seguidas en los ultimos tres nucleotidos • PCR con primers en solitario PCR degenerada

13. PCR reversa

14. Touch-down PCR Nested touch-down PCR PCR reversa

15. Nested PCR Y bp X bp Fragmento A: Z pb X bp Y bp Fragmento B: Z -(X+Y)pb

16. Touch-down PCR 94ºC 60-65ºC

17. RE2 RE1 RE1 RE2 RE1 RE2 RE2 RE1 Introduciendo sitios de restricción

18. RE2 RE1 • PCR en condiciones de baja fidelidad • Desbalance de nucleotidos • Mn ++ en vez de Mg++ • Polimerasas mutantes RE1 RE1 RE1 RE1 RE1 RE1 RE1 RE1 RE1 RE1 RE2 RE2 RE2 RE2 RE2 RE2 RE2 RE2 RE2 RE2 Mutagénesis al azar localizada

19. MUT1 RE2 RE1 MUT2 RE1+MUT1 RE2+MUT2 RE2 RE1 RE1 RE2 Mutagénesis sitio-específica