Elettrofisiologia e Biofisica di Membrana Laurea Magistrale in Neurobiologia Docente: Prof. Mauro Toselli mtoselli@unipv

1. Elettrofisiologia e Biofisica di Membrana Laurea Magistrale in Neurobiologia Docente: Prof. Mauro Toselli mtoselli@unipv.it Potrete scaricare gli argomenti trattati a lezione al seguente indirizzo web: www.unipv.it/tslmra22 Vol II-III Durante il corso: una esercitazione obbligatoria Occorre fornire il proprio indirizzo di posta elettronica

2. Di cosa si occupa la Biofisica In questo corso ci occuperemo di biofisica della cellula con particolare riguardo alle cellule elettricamente eccitabili e a quei fenomeni in cui è coinvolta la membrana cellulare

3. Diffusione e flussi Trasporti mediati Equazione di Nernst Legge di Ohm Potenziale di Membrana

4. Perché parlare del concetto di diffusione? E’ una proprietà fisica fondamentale di tutti i processi biologici e costituisce il motore tramite il quale le cellule possono generare segnali

5. Qualche esempio • È attraverso flussi diffusionali che molecole nutritizie e O2 passano dal sangue alle cellule dei vari tessuti. • Un evento fondamentale che sta alla base del funzionamento dei neuroni, la genesi del potenziale d’azione, è prodotto dalla diffusione di ioni Na+ dentro la cellula nervosa. • La trasmissione sinaptica, un evento fondamentale per la comunicazione neuronale, avviene per diffusione del neurotrasmettitore dal teminale pre-sinaptico di un neurone al terminale post-sinaptico di un altro neurone. • La conoscenza della velocità di diffusione di un farmaco nell’organismo (farmacocinetica) fino al raggiungimento delle cellule bersaglio è fondamentale per la prescrizione del dosaggio.

6. Energia Termica = kT (u.d.m. joules) costante di Boltzmann 1.38x10-23 joules/oK temperatura assoluta 300oK a temperatura ambiente Nota: k ·N(Numero di Avogadro) = R (costante dei gas) = P·V/T Che cosa spinge le particelle a diffondere? La diffusione è il movimento molecolare generato dall’energia termica: moti browniani (A. Einstein) Che cos’è l’Energia Termica?

7. 1 [moli/(cm2·sec)] 2 Flusso netto: Diffusione di Soluti Flusso Molare Unidirezionale: Quantità di soluto (in moli) che attraversa un’area unitaria nell’unità di tempo Dove: n=no particelle N= numero di Avogadro A=area T=tempo

8. d [ C ] flusso µ dx C La costante di proporzionalità è il coefficiente di diffusione (D) d [ C ] flusso = = - F D Xo X dx Prima Legge di Fick Il flusso è proporzionale alla pendenza del gradiente di concentrazione

9. Quali sono le unità di misura del coefficiente di diffusione (D) ? mol 3 mol cm mol = = D D · · 2 4 cm s cm · 2 cm = D s

10. t0 t1 t2 t3 Seconda legge di Fick “L’Equazione della Diffusione" Le unità di misura del flusso sono: Ammontare di C per Area per Secondo; Dal momento che il flusso si sviluppa nel tempo, il risultante movimento di C causa un corrispondente cambiamento della sua concentrazione nel tempo

11. Seconda legge di Fick: il tempo necessario affinchè ad una certa distanza dalla sorgente della diffusione, la concentrazione del soluto raggiunga un determinato livello, cresce col quadrato della distanza Per risolvere quest’equazione differenziale occorre specificare una condizione iniziale e due condizioni al contorno, quindi essa ha più soluzioni diverse, Condizione iniziale: a t=0 tutte le No particelle sono concentrate nell’area (A) Condizioni al contorno: (1.) la concentrazione è finita ovunque. (2.) il numero totale di particelle (N0) è costante. allora la soluzione sarà: Inoltre, essendo: sarà:

12. C 0.05 = Dt 0.1 -1.2 -0.8 -0.4 0 0.4 0.8 1.2 Concentrazione (C) Distanza (x) 0.3 1.0 0.0 0.4 1.2 1.6 0.8 Distanza (x) La relaziomne tra concentrazione (C) e distanza (x) è simmetrica rispetto all’origine per valori positivi e negativi di x Ciascuna linea è un’istantanea del profilo spaziale della concentrazione in funzione della distanza a tempi diversi dalla partenza del processo diffusivo Mostra il profilo spaziale della concentrazione ad un tempo fisso Si tratta di una curva di Gauss (distribuzione normale)

13. Ia Legge di Fick per la diffusione flusso diffusivo C’è un flusso netto di soluto dalla zona ad alta concentrazione a quelle a bassa concentrazione Il flusso è proporzionale alla pendenza del gradiente di concentrazione La costante di proporzionalità dipende dalla mobilità del soluto D µ F C Da cui si ricava che, allo stato stazionario: d

14. Diffusione attraverso una membrana aspetti quantitativi animazioni Rappresentazione grafica del processo di diffusione

15. Lato est. Lato int. Prima legge di Fick della diffusione attraverso una membrana Assumiamo: - Vi e Vo sono costanti - i bagni sono ben mescolati - vale il principio di conservazione della materia e la membrana è sottile: ciVi+coVo=N - la membrana si trova sempre allo stato stazionario: F=P(ci-co) (P≡perm. della membr. al soluto)

16. 37% di (co - c∞) = 143 63% di (c∞- co) = 77 Diffusione attraverso una membrana la concentrazione di soluto varia nel tempo con un andamento esponenziale ceq=110 t

17. Gas Piccole molecole polari non cariche Etanolo Acqua Urea Grosse molecole polari non cariche Glucosio Ioni Molecole polari cariche Aminoacidi ATP Glc-6-P Una membrana costituita da un puro bilayer fosfolipidico è impermeabile alle proteine, alla maggior parte delle piccole molecole e agli ioni

18. Passaggio attraverso la membrana di particelle mediante proteine di trasporto

19. Caratteristiche dei trasporti mediati • I carriers sono dotati di specificità • Sono soggetti a saturazione • Possono essere bloccati dagli inibitori competitivi • Hanno un’elevata dipendenza termica e dal pH

20. I trasportatori hanno le caratteristiche di enzimi • I carriers agiscono cataliticamente come gli enzimi • Legano selettivamente il loro substrato, cioè la • molecola che deve essere trasportata • Cambiano di conformazione per rilasciare il • substrato dall’altro lato • Ritornano alla conformazione originale per legare • un’altra molecola di substrato • Seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten

21. Analisi cinetica del transporto di una molecola tramite proteina carrier: saturazione Fmax 20 s] 15 × 2 F=kdDC 10 Flusso netto [moli/(cm 5 0 104 0 50 100 150 200 D C (mM) 300 200 F 100 0 0 10 20 30 D C In base alla Ia legge di Fick il flusso di particelle che diffondono liberamente aumenta linearmente all’aumentare della concentrazione Ma la Ia legge di Fick non viene più rispettata se si tratta di un flusso di particelle attraverso la membrana mediato da carriers I flussi mediati da carriers -a differenza della diffusione libera - sono saturanti • Ciò accade per due motivi: • Sulla membrana è presente un numero finito di carriers; • Ciascun carrier opera ad una velocità finita

22. Rappresentazione del concetto di saturazione con un esempio numerico Per semplicità consideriamo una membrana con un solo carrier Velocità del carrier: 50 part./s 50 40 30 N. partic. Vel. (p./s) Flusso (Particelle/Carrier/s) 20 1 1 10 10 10 50 50 0 100 50 0 800 1000 1000 50 N. particelle

23. Quesito su cui meditare Distruggendo, o bloccando irreversibilmente con un farmaco la metà dei carriers sulla membrana, Fmax rimarrebbe inalterata, aumenterebbe o diminuirebbe?

24. C1 Cellule in sospensione F1 C1 20 5 s] × 2 15 pendenza della retta 4 º 10 3 Flusso netto [moli/(cm in [S] 2 5 1 0 0 20 40 60 80 100 0 C (mM) 0 10 20 30 40 50 Tempo Come sono stati ottenuti i dati del grafico che illustra come varia il flusso al variare della concentrazione? ? • Si introduce nella provetta il substrato S radioattivo ad una concentrazione C1 • A tempi successivi (t0, t1, t2, t3, …) si preleva un campione dalla provetta e si misura la concentrazione di S radioattivo all’interno delle cellule del campione • Dividendo la velocità v1per l’area della membrana si ottiene il primo valore del flusso F1 riferito alla concentrazione C1 (vedere definizione di flusso)

25. C2 C3 C4 F4 F3 F2 F1 C2 C3 C4 C1 V4F4 40 20 30 s] × V3F3 2 15 20 in 10 [S] Flusso netto [moli/(cm V2F2 10 5 0 0 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 Tempo D C (mM) Successivamente si introduce in ciascuna provetta substrato S radioattivo alle altre concentrazioni C2, C3, C4 …. crescenti e si ripete la stessa procedura descritta precedentemente

26. Fmax 20 s] 15 + Ic × 2 10 Flusso netto [moli/(cm + Ic 5 0 104 0 50 100 150 200 D C (mM) I carriers, come gli enzimi, possono essere soggetti ad inibizione competitiva

27. substrato [S] [Ic] Prob Inibitore comp. 20 .01 10 .001 .1 10 .010 15 1 10 .091 10 Flusso 10 10 .5 5 100 10 .909 1000 10 .990 0 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 10000 10 .999 [S] S S+Ic Come funziona un inibitore competitivo? solo S S << Ic S >> Ic Se si vuole costruire un grafico che rappresenti un range di concentrazioni molto ampio (alcuni ordini di grandezza) conviene rappresentare le concentrazioni in scala logaritmica

28. 20 s] × 2 15 10 Flusso netto [moli/(cm 5 20 ka3 0 ka1 ka2 10 20 30 0 s] 15 × D C (mM) 2 10 Flusso netto [moli/(cm 5 0 0 50 100 150 200 D C (mM) In presenza di Ic varia ka Mentre, il valore di Fmaxnon cambia Calcolo della costante di affinità ka kaè quel valore di concentrazione del substrato al quale il flusso è la metà di quello massimo kaè inversamente proporzionale all’affinità del carrier per il substrato

29. Conc. mM v (mmol/s) 0.1 3.0 1 10.0 5 16.7 10 18.2 20 19.0 30 19.4 50 19.6 100 19.8 200 19.9 Quesito del giorno • Un ricercatore trova che la velocità con cui una sostanza è trasportata all’interno di certe cellule varia al variare della sua concentrazione come illustrato in tabella. • Trovare i corrispondenti valori di flusso sapendo che l’area di membrana su cui sono state fatte le misure è 3·10-2 cm2; • Rappresentare graficamente i valori del flusso al variare della concentrazione di substrato in due grafici distinti ove le concentrazioni sono rappresentate rispettivamente in forma lineare e logaritmica; • Ricavare dal grafico i valori di Fmax e ka.

30. 700 700 600 600 500 500 2 2 400 400 mmoli/s/cm mmoli/s/cm 300 300 200 200 100 100 0 0 0 50 100 150 200 0.01 0.1 1 10 100 Concentr. Concentr. Risposta al quesito

32. Migrazione in un campo elettrico t0 t1 ovvero: La costante di proporzionalità dipende dalla mobilità e dalla concentrazionedel soluto è la pendenza del gradiente elettrico C’è un flusso netto di cationi (K+) verso il catodo (polo -) e di anioni (Cl-) verso l’anodo (polo +)

33. cariche - cariche + Anioni Cationi Citoplasma Spazio extracell. { membrana Equazione di Nernst-Planck: Una differenza di cariche (Δq) ovvero di potenziale elettrico (ΔV) ai due capi della membrana influenza il movimento degli ioni Quindi, il flusso di particelle cariche dipende non solo dal gradiente di concentrazione ma anche dal gradiente elettrico

34. Equazione di Nernst Permette di calcolate il potenziale di equilibrio di una specie ionica note le sue concentrazioni all’equilibrio a cavallo della membrana

35. Nu/N u Legge di distribuzione di Boltzmann Ogni curva di distribuzione ha la forma di una campana irregolare e asimmetrica. E' una legge sperimentale che rappresenta il numero di particelle Nu che possiedono una certa energia, in funzione dell'energia stessa u: cioè ad ogni valore di energia (a una data temperatura T) corrisponde un numero definito di particelle con quella energia. A T1 < T2 la maggior parte delle molecole è distribuita in un intervallo più ridotto di u: poche molecole perciò potranno avere u sufficiente per superare la barriera energetica. All'aumentare della T (curva T2) aumenta il numero di molecole con u sufficiente, perciò aumenta la velocità della reazione. Le aree sottese dalle due curve sono eguali poiché rappresentano lo stesso numero totale di molecole N

36. k cost. di Boltzmann T temp. assoluta u2-u1=DG variaz. di energia libera Energia D u Stato 1 Stato 2 L’equazione di Nernst è ricavabile dall equazione di Boltzmann della meccanica statistica Equazione di Boltzmann Mette in relazione le probabilità di una particella di trovarsi nello stato energetico  o nello stato energetico  con le differenze di energia u2-u1=Du tra i due stati: La particella spende il minor tempo nello stato ad energia maggiore

37. Passando dalle probabilità P alle concentrazioni c e dall’energia di una singola particella u all’energia molare U, si ottiene: c1 c2 ovvero: R cost. dei gas (R=k·N, Nno di Avogadro) U2-U1=Dm è l’energia molare (potenziale chimico) ed espressa in joules/mole Nel caso di particelle elettricamente cariche, se U2-U1è la differenza di potenziale elettrochimico molare di uno ione permeante, dovuta alla differenza di potenziale di membrana V2-V1, e se la carica dello ione è z, allora: All’equilibrio U2-U1=0: che è l’equazione di Nernst!

38. 0 - - - - + + + + - - + + K+ K+ K+ K+ K+ - - - - - - + + + + Na+Cl- 100 mM K+Cl- 100 mM + + ΔE ΔC ΔE ΔC ΔE ΔC Quando si applica l’equazione di Nernst: membrana permeabile ad almeno una specie ionica ed impermeabile ad almeno un’altra All’equilibrio: flusso dovuto al gradiente di conentrazione = flusso dovuto al potenziale elettrico Si tratta di un equilibrio elettrochimico: Equilibrio di Donnan

39. to t1 t2 fusso dovuto al gradiente di concentrazione fusso dovuto al gradiente elettrico La lunghezza delle frecce indica l’intensità dei flussi All’equilibrio, applicando l’equazione di Nernst sarà: Ovvero: (Equazione di Donnan) Equilibrio di Donnan

40. Conseguenze: • Viene prodotta una differenza di potenziale transmembranaria ΔV stabile nel tempo; • La concentrazione totale degli ioni diffusibili (K+ e Cl-) è maggiore dal lato dove si trova lo ione non diffusibile (Pr-): • [K+]2+[Cl-]2>[K+]1+[Cl-]1 Vi è un aumento di pressione osmotica dal lato dello ione non diffusibile

41. In tutte le cellule c’è una differenza di potenziale a cavallo del plasmalemma stabile nel tempo (pot. di riposo) Potenziali di equilibrio dei vari ioni in alcuni tipi di cekllule conc.extracell. (mM/litro) 20 440 560 2.5 120 120 5 145 110 conc.intracell. (mM/litro) 400 50 40 139 20 3.8 140 5 4 pot. di Eq. (mV) -75 +55 -66 -102 +45 -88 -90 +91 -89 Cellula Assone gigante di Calamaro Fibrocellula muscolare di Rana Neurone di Mammifero  ione K+ Na+ Cl- K+ Na+ Cl— K+ Na+ Cl-

42. Domanda molto pertinente: visto che il PR si mantiene costante nel tempo (e così pure le concentrazioni ioniche), si può dire che a cavallo della membrana sussiste un equilibrioelettrochimico ? La risposta è NO Infatti, il PR non coincide col potenziale di equilibrio (potenziale di Nernst) per nessuna delle specie ioniche presenti. A 18°C …. conc.extracell. (mM/litro) 20 440 560 2.5 120 120 5 145 110 conc.intracell. (mM/litro) 400 50 40 139 20 3.8 140 5 4 pot. di Eq. (mV) -75 +55 -66 -102 +45 -88 -90 +91 -89 RP (mV) -60 -90 -80 Cellula Assone gigante di Calamaro Fibrocellula muscolare di Rana Neurone di Mammifero  ione K+ Na+ Cl- K+ Na+ Cl— K+ Na+ Cl-

43. 1 1 1 2 2 2 Na+Cl- 100 mM K+Cl- 100 mM + + + + - - - - - - + + K+ K+ Na+ Na+ - - + + + + + - - - pK>pNa pK>pNa fK>fNa fK=fNa Quando si genera un potenziale di diffusione: Si genera quando la membrana è permeabile in misura diversa alle varie specie ioniche t1 t2 • Il suo raggiungimento comporta: • Equilibrio elettrico ma squilibrio elettrochimico • Flusso netto non nullo delle varie specie ioniche • Un potenziale di diffusione non si mantiene indefinitivamente

44. + Cl- K Na+ GENESI DEL POTENZIALE DI MEMBRANA Il potenziale di membrana è una conseguenza di una permanente differenza di concentrazione ionica ai due capi della membrana • Questa è prodotta da: • una membrana permeabile in maniera selettiva ma con valori diversi di permeabilità a diverse specie ioniche (potenziale di diffusione) • flussi passivi e attivi degli ioni permeanti

45. Equazione di Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) per il Voltaggio [ ] [ ] [ ] æ + + - + + ö P K P N a P C l R T K N a Cl ç ÷ O O i = V l n [ ] [ ] [ ] è ø + + - m + + F P K P N a P C l K N a Cl i i O Qualora la membrana fosse permeabile solo al K+ (cioè PNa=0 e PCl=0): [ ] [ ] æ ö æ ö + + P K K R T R T ç ÷ ç ÷ = K E = l n = l n O O V K [ ] [ ] m è ø è ø + + F P K F K K i i Se il potenziale di membrana Vm è dovuto ad un potenziale di diffusione, esso non coinciderà con nessuno dei potenziali di equilibrio delle specie ioniche permeanti (Vm≠ Ei). In questo caso, invece dell’equazione di Nernst vale la seguente equazione: che è derivata dall’equazione di Nernst-Plank per i flussi:

46. Ione Citoplasma Extracell. (mM) + Na 10 120 + K 120 3 PK:PNa=10:1 PK:PNa=1:1 Quesito In base ai dati indicati in tabella e sapendo che la membrana è permeabile a Na e K con il seguente rapporto di permeabilità: PK : PNa = 10 : 1, calcolare il potenziale di membrana Vm applicando l’equazione di GHK. Confrontare il valore trovato con quello che si otterrebbe se PK:PNa=1:1.

47. È possibile costruire un modello circuitale elettrico equivalente della membrana Ciò semplifica la trattazione dei fenomeni bioelettrici di membrana

48. A questo punto, però, sarà bene andare a ripassare le principali leggi che regolano i circuiti elettrici e i principali elementi passivi che li costituiscono

49. La convenzione standard per la corrente di membrana è: cariche (+) che si muovono fuori dalla cellula generano una corrente positiva La convenzione standard per il potenziale di membrana è: Em= (Ψe-Ψi) Potenziale intracellulare Potenziale del bagno Ψi +Im Ψe -Im Definizione di potenziale elettrico A ha un potenziale elettrico più elevato di B se connettendo A e B con un conduttore una corrente positiva fluisce da A a B L’energia immagazzinata nel potenziale elettrico è in grado di compiere un lavoro dal momento che le cariche si muovono da un alto a un basso valore del potenziale

50. ENa Est Int + Il gradiente di concentrazione dell’Na+ è orientato in modo da mandare cariche positive nella cellula qualora l’Na+ possa passare Da un punto di vista elettrico ciò equivale a dire che esiste una batteria al Na+ con un determinato orientamento Nonostante esista un gradiente di concentrazione dell’Na+, cioè una batteria al Na+, per il momento non c’è flusso di corrente perché il canale del Na+ è per ora chiuso! Cioè, da un punto di vista circuitale ciò equivale a dire che per il momento il circuito è aperto