Les enzymes : outils de biologie moléculaire

3. Les enzymes : outils de biologie moléculaire • Enzymes de restriction: endonucléases • Kinases: ajoutent un phosphate (P*) • Phosphatases: retirent un phosphate • Ligases: joignent un OH et un phosphate • ADN Polymérase: ADN => ADN • Reverse transcriptase : ARN => ADNc

4. Nomenclature des enzymes de restriction

6. Vecteurs de clonage • Tailles des séquences incluses • Plasmide bactérien ( 3-4 kb ) • Phage λ( 9-22 kb ) • Cosmide ( ≈ 45 kb ) • PAC : P1-derived Artificial Chromosome ( 75-95 kb ) • BAC : Bacterial Artificial Chromosome ( 100-350 kb ) • YAC : Yeast Artificial Chromosome ( 300-1000 kb )

9. NOMBRE DE CLONES A OBTENIR

12. PROJET PUBLIC: ETAPE 1

13. PROJET PUBLIC: ETAPE 2

14. PROJET PRIVE : CELERA

15. PCR : Polymerase Chain Reaction • Amplification d’ADN. • Base pour différentes techniques de biologie moléculaire : • Séquençage • Amplification de l’ADN pour le clonage • mutation ponctuelle • « differential display » • préparation d’ADNc « RT-PCR » • détermination de polymorphisme entre génomes (RFLP…) • ….

18. Séquençagenucléotide : méthode de Sanger • ddNTP : analogues structuraux des dNTP. • ddNTP : incapables de réaliser une liaison phosphodiester. • ADN polymérase incorpore dNTP ou ddNTP.

19. Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

20. Séquençage : Méthode de SangerÉlectrophorèse

21. Séquençagenucléotide : méthode de Sanger • Liaison de l’amorce avec l’ADN à séquencer. • La fixation des ddNTP aux brins d’ADN va créer des brins de différentes tailles. • Les brins vont migrer sur un gel d’électrophorèse selon leur taille : le plus petit migre le plus vite.

22. Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

23. Séquençagenucléotide : méthode de Sanger • Automatisation de la méthode : • Ajout sur les ddNTP de fluorochrome de différentes couleurs. • 1 seul tube regroupant les ddNTP. • Lecture par un laser des fragments qui migrent sur le gel. • Stockage des données dans la mémoire de l’ordinateur.

24. Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

25. Les ddNTPs fluos

27. Séquençagenucléotide : méthode de Sanger

29. Automatisation • Séquençage sur capillaires :megabace • Permet de séquencer 96 ou 386 échantillons en parallèle

35. RESTE A LIRE LA SEQUENCE ET COMPRENDRE TOUTES LES INFORMATIONS CONTENUES DANS LE GENOME ANNOTATION DU GENOME

36. Comment fonctionne le génome Quelle est l’organisation du génome? Comment est lue l’information contenue dans le génome? Mise en place du programme génétique

37. Paradoxe !!!!

38. Complexité du génome Humain • Taille 3 200 Mb pour 30 000 gènes • Nature répétitive • Séquences répétées localement • ADN satellite • Séquences répétées dispersées • SINES (Short Interspersed Repeated Sequences) • Ex: ALU, 300 pb tous les 6000 nucleotides • LINES (Long Interspersed Repeated Sequenes) • Ex: L1, 5 kb, 100 000 copies dans génome • Rôle de l’ADN non génique ??? • Régulation globale de l’expression des gènes • Nucléosquelette

39. Complexité du génome humain • Pourquoi les gènes sont dispersés? • Pourquoi autant de répétitions? • Pourquoi les gènes sont morcelés? • Toutes les parties du génome sont elles utilisées dans toutes les cellules? • Le génome évolue t-il avec la spécialisation des cellules?

40. Epissages alternatifs

42. Complexité du génome humain • Pourquoi les gènes sont dispersés? • Pourquoi autant de répétitions? • Pourquoi les gènes sont morcelés? • Toutes les parties du génome sont elles utilisées dans toutes les cellules? • Le génome évolue t-il avec la spécialisation des cellules?

45. Initiation de la transcription Répresseur Activateurs FT FT FT RNA Pol II Région codante Promoteur basal Coactivateurs Facteurs d’initiation

46. Régulation du niveau d’expression des gènes

47. Interaction protéine -ADN

48. Interaction protéine – ADN

49. Quelques chiffres sur le génome • Exons 1.1 % du génome • Introns 70 % du génome • Partie avec fonction inconnue  80% • Gènes protéiques  5% • Gènes d’ARN spécifiques (ARNt,r)  <2% • Gènes régulateurs (réplicateurs, recombinateurs, ségrégateurs)  # 10%

50. Identifier les gènes spécifiques d’un tissu Tous les gènes possibles ADN Tous les gènes nécessaires