Proteīnu rentgenstruktūranalīze

1. Proteīnu rentgenstruktūranalīze Jānis Leitāns (jl10056)

2. Metodes nozīme • Metode lielmolekulāru savienojumu (proteīnu vai nukleīnskābju) struktūras noteikšanai. • Iegūstot vizuālu 3-dimensionālu proteīna modeli ir iespējams spriest par to, kā tas pilda savas funkcijas, kā arī racionāli uzlabot zāļu dizainu dažādiem farmakoloģiski nozīmīgiem enzīmiem.

3. Vēsture • 1895. gadā Vilhelms Rentgens atklāj rentgenstarus. • Pirmo vielas 3D struktūru izmantojot rentgenstruktūranalīzi noteica Bregs 1913. gadā (parastais sāls). • 1953. gadā Džeimss Votsons un Frānsiss Kriks noteica DNS dubultspirāles struktūru (difrakcijas attēlus ieguva Rozalinda Franklina). • Pirmo proteīna struktūru ar šo metodi noteica Džons Kendrevs 1962. gadā (mioglobīns). • Kopš tā laika ir pasniegtas vairākas Nobela prēmijas tieši par strukturālajiem pētījumiem, tai skaitā 2012. gadā Braiens Kobilka saņēma Nobela prēmiju ķīmijā par G-proteīnu saistītajiem receptoriem.

4. Kas ir nepieciešams lai noteiktu proteīna struktūru • Proteīna gēna klonēšana; • Proteīna producēšana (parasti E.coli); • Proteīna attīrīšana; • Proteīna kristalizācija; • Datu vākšana no kristāliem; • Datu analīze; • Struktūras validēšana.

5. Kristalizēšana • Parasti nav iespējams prognozēt kristalizēšanās apstākļus un nākas pārbaudīt vairākus simtus apstākļu līdz tiek iegūts proteīna kristāls. • Lai atvieglotu šo procesu ir speciālas iekārtas – kristalizācijas roboti. • Kristalizācijas roboti – pipetēšanas iekārtas, kas spēj operēt ar ļoti maziem tilpumiem (sākot no 0,1 µl).

6. Kristalizēšana Kristalizācijas plate 96 paraugiem Proteīns ar pievienoto precipitantu (attiecība 1:1) Precipitants Iztvaikošanas rezultātā lēnām paaugstinās proteīna-precipitanta koncentrācija. Sēdošā piliena kristalizēšanas tehnika

7. Kristāli parasti aug lēni (no pāris stundām, līdz pat mēnešiem); • Nosakot kristalizēšanās apstākļus, tos iespējams optimizēt, lai veidotu lielākus kristālus ar labāku difrakciju. Butirobetaīna hidroksilāzes kristāli (20% PEG 3350, 3% 1,6 diamineheksāns, 10 mM ZnSO4, 0,2 M amonija citrāts pH 7,0) Ogļskābes anhidrāzes IX mimētiķa kristāli (1.3M Na-citrate, 100 mM tris-HCl pH 9,0)

8. Lizocīma kristālu veidošanās

9. Datu vākšana • Kad kristāli iegūti, tos analizē ar spēcīga rentgenstaru avota –sinhrotrona (daļiņu paātrinātājs) vai rotējošā anoda rentgenstaru lampas palīdzību. ESRF sinhrotrons Grenoblē, Francijā.

10. Rotējošā anoda rentgenstaru lampas virsējā daļa

11. Kāpēc rentgenstari? • Rentgenstari ir elektromagnētiskie viļņi ar viļņa garumu robežās no 10 nanometriem līdz 100 pikometriem. • Rentgenstruktūranalīzē parasti izmanto aptuveni 150 pikometru viļņa garumu. • Šādu viļņa garumu izmanto, jo viļņa garuma izmērs ir aptuveni tāds pats, kā attālums starp atomiem molekulā.

12. Atomos esošie elektroni rentgenstaru iedarbības rezultātā veido sekundāros rentgenstarus, kas savukārt mijiedarbojas viens ar otru, beigās veidojot difrakcijas attēlu. • Difrakcijas attēls veidojas viļņu interferences rezultātā un tas ir atkarīgs no elektronu skaita un to savstarpējā novietojuma. Sekundārie stari Primārais stars

13. Uz viena difrakcijas attēla ir tikai maza daļa no iespējamajiem difrakcijas punktiem. Kristālu rotējot par 0,2 līdz 2 grādiem tiek iegūti vairāki desmiti/simti difrakcijas attēlu. Lizocīma kristāla difrakcijas attēls Lizocīma shematisks struktūras attēls

14. Datu analīze • Iegūtos datus analizē ar dažādām programmām, piemēram, WinCoot un CCP4i pakas esošajām programmām. • Pēc datu apstrādes tiek iegūts precīzs elektronu blīvuma sadalījums molekulā.

15. Ogļskābes anhidrāzes II aktīvais centrs ar tam piesaistījušos ligandu – uzzinot precīzu enzīma aktīvā centra izvietojumu, ir iespējams modelēt konkrētajam enzīmam atbilstošus inhibitorus (racionāls zāļu dizains).

16. Mutāciju pārbaude strukturālā līmenī

17. Rentgenstruktūranalīzes un KMR salīdzinājums • Alternatīva metode rentgenstruktūranalīzei – kodolmagnētiskā rezonanse (KMR); • Ar KMR palīdzību ir problēmas noteikt struktūru proteīniem, kuru garums pārsniedz 30 kDA; • Gandrīz 90% no proteīnu datu bankā esošajām struktūrām ir noteiktas ar rentgenstruktūranalīzes metodi; • Abām metodēm nepieciešama ļoti dārga aparatūra (rotējošais anods=400 000 eiro, sinhrotrons=miljardi eiro); • Kristalizēšanas apstākļus ne vienmēr izdodas atrast; • Abām metodēm nepieciešams liels daudzums proteīna – ekonomisko apsvērumu dēļ bieži reālistiska ir tikai E.coli ekspresijas sistēma.

18. Izmantotā literatūra • Wlodawer A, Minor W, Dauter Z, Jaskolski M. 2008. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures.FEBS J., 275(1):1-21. • Wlodawer A, Minor W, Dauter Z, Jaskolski M. 2013. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J., 280(22):5705-36. • Blundell TL, Patel S. 2004. High-throughput X-ray crystallography for drug discovery.CurrOpinPharmacol., 4(5):490-6. • http://www.proteincrystallography.org/ • http://en.wikipedia.org/wiki/X-ray_crystallography • http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_structure • http://www.proteinstructures.com/Experimental/Experimental/protein-crystallography.html

19. Paldies par uzmanību!

20. Jautājums Kādēļ šajā metodē tiek izmantoti tieši rentgenstari?