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DOSAGGIO ENZIMATICO

DOSAGGIO ENZIMATICO. ANALISI DELL’ATTIVITà ENZIMATICA DI UNA PROTEINA MEDIANTE L’UTILIZZO DELLO SPETTRO FOTOMETRO. SI ANALIZZA LA COMPARSA DI UN PRODOTTO DELLA REAZIONE O LA SCOMPARSA DI UN SUBSTRATO. PER POTER QUANTIZZARE UN ENZIMA OCCORRE CONOSCERE BENE IL SUO MECCANISMO DI AZIONE.

nitesh
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DOSAGGIO ENZIMATICO

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Presentation Transcript

  1. DOSAGGIO ENZIMATICO ANALISI DELL’ATTIVITà ENZIMATICA DI UNA PROTEINA MEDIANTE L’UTILIZZO DELLO SPETTRO FOTOMETRO. SI ANALIZZA LA COMPARSA DI UN PRODOTTO DELLA REAZIONE O LA SCOMPARSA DI UN SUBSTRATO. PER POTER QUANTIZZARE UN ENZIMA OCCORRE CONOSCERE BENE IL SUO MECCANISMO DI AZIONE. OGNI SINGOLO ENZIMA HA UN SUO DOSAGGIO SPECIFICO.

  2. LEGGE DI BEER A = εcb A = ASSORBANZA O DENSITà OTTICA (OD). CORRISPONDE ALLA FRAZIONE DI ENERGIA RADIANTE. ε = COEFFICIENTE DI ESTINZIONE MOLARE, L’ASSORBIMENTO DI UNA MOLE DI COMPOSTO CON SPESSORE UNITARIO AD UNA DATA LUNGHEZZA D’ONDA C = CONCENTRAZIONE DELLA SPECIE IN ESAME (MOL/LITRI). b = CAMMINO OTTICO IN cm

  3. I Ia 1 cm I T = Ia T = TRASDUTTANZA. Ia = INTENSITà DELLA RASIAZIONE INCIDENTE I = INTENSITà DELLA RASIAZIONE USCENTE SCHEMA DI UNO SPETTROFOTOMETRO

  4. OD D min Min. 1 2 3 4 5 6 7 8 Tipi di DOSAGGIO DIRETTO INDIRETTO SFRUTTA I COMPONENTI DELLA REAZIONE O I PRODOTTI. UN ESEMPIO è IL DOSAGGIO DELLA GLUTATIONE-S-TRANSFERASI NON POTENDO SFRUTTARE I COMPONENTI DELLA REAZIONE O I PRODOTTI SI ACCOPPIA UN’ALTRA REAZIONE. UN ESEMPIO è IL DOSAGGIO DELL’ESOCINASI DOSAGGIO SI UTILIZZA UN PROGRAMMA DI LETTURA CHE LEGGE IL CAMPIONE A INTERVALLI DI TEMPO

  5. DOSAGGIO DELLA GLUTATIONEREDUTTASI GR TNB-S-GLUTATIONE + NADP DtNB + GS-SG + NADPH LEGANDOSI AL GLUTATIONE IL DTNB, ASSORBE A 412nm DOSAGGIO DELl’ESOCINASI HK Glucoso +ATP Glucoso-6-P +ADP QESTA REAZIONE NON HA ELEMENTI CHE ACMBIANO IL LORO ASSORBIMENTO. PER QUESTO MOTIVO SI ACCOPPIA UN’ALTRA REAZIONE CON LA G6PD G6PD 6-fosfogluconato + NADPH Glucoso-6-P + NADP IL NADPH HA UN ASSORBIMENTO CARATTERISTICO A 340 nm

  6. Spettro d’assorbimento NAD/NADH Dosaggio dell’attività enzimatica e calcolo dell’affinità (Km) • Dosaggio di un enzima • Dosaggio con i reattivi per la Km • Costruzione del grafico della costante di Michelis-Manten • Costruzione del grafico dei doppi reciproci • Individuazione grafica della Km.

  7. Dosaggio di un enzima Viene utilizzato come enzima la Glutatione Reduttasi (E.C. 1.6.4.2.) • La Glutatione Reduttasi(GR) è necessaria per la rigenerazione del glutatione ridotto, che è importante per un normale metabolismo cellulare • La glutatione reduttasi è un enzima NAD(P)H e flavina adenina dinucleotide (FAD)-dipendente che si trova negli eritrociti. L’enzima catalizza l’ossidazione del glutatione ossidato (GS-SG) per formare glutatione ridotto (GSH). Cosa fa la GR? GSSG + NADPH GR 2GSH + NADP+

  8. Cosa è la Km? È la concentrazione di substrato alla quale la velocità dell’enzima è pari a Vmax/2 Curva di Michealis e Manten Come si calcola la Km? Il metodo migliore e più preciso è quello di riportare i dati cinetici su un grafico dei doppi reciproci. Grafico dei doppi reciproci

  9. Come si misura la Km? Per calcolare la Km di un enzima si effettuano diversi dosaggi mantenendo costante la concentrazione dell’enzima e variando invece la concentrazione del substrato per cui si intende trovare la relativa Km. Nel nostro caso cercheremo di trovare la Km della Glutatione Reduttasi per il GSSG

  10. DOSAGGIO ENZIMATICO DOSAGGIO DELLA KM * concentrazioni GSSG: 4 8 12 16 20 24 μM.

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