Fermentação – Caminhos Metabólicos

1. Universidade Federal de PelotasCentro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTecGraduação em BiotecnologiaDisciplina de BIOPROCESSOSProfa. Dra. Patrícia S. Diaz Fermentação – Caminhos Metabólicos

3. Introdução • As definições de fermentação são variadas, desde de uma definição informal até uma mais científica, como por exemplo: • Fermentação é: • Qualquer deterioração de alimentos por microrganismos (uso geral); • Qualquer processo que produza bebidas alcoólicas ou laticínios (uso geral); • Qualquer processo microbiológico em grande escala ocorrendo com ou sem ar (definição comum usada na indústria); • Qualquer processo metabólico que libere energia que ocorra somente sob condições anaeróbias (mais científica); • Qualquer processo metabólico que libere energia de um açúcar ou outra molécula orgânica, não requer oxigênio ou um sistema transportador de elétrons e usa uma molécula orgânica como aceptor final de elétrons.

4. Nós definiremos fermentação como um processo que: Libera energia de açúcares ou moléculas orgânicas, tais como aminoácidos, ácidos orgânicos, purinas e pirimidinas; Não requer oxigênio (processo anaeróbio), entretanto em alguns processos ocorre na presença de oxigênio (processo aeróbio); Não requer o uso do ciclo de Krebs (embora no processo aeróbio seja usado) ou de uma cadeia transportadora de elétrons; Utiliza uma molécula orgânica como aceptor final de elétrons (alguns microrganismos utilizam moléculas inorgânicas); Produz quantidades pequenas de ATP (somente uma ou duas moléculas de ATP por molécula de material inicial), porque grande parte da energia original da glicose fica retida nas ligações químicas do produto final.

5. Atenção: Cultivo ≠ Fermentação

6. Vias metabólicas de produção de energia Os organismos liberam e armazenam energia de moléculas orgânicas por meio de uma série de reações controladas por enzimas. Para isso, os organismos passam elétrons de um composto a outro por meio de uma série de reações de oxidação e redução. Via metabólica  é uma série de reações químicas, catalisadas por enzimas, que ocorrem dentro de uma célula. Catabolismo: é o processo pelo qual os compostos orgânicos complexos são fracionados em compostos químicos mais simples, produtos residuais e, em geral, liberam energia. As reações catabólicas têm o propósito de capturar a energia química obtida da degradação de moléculas ricas em energia, formando ATP. A energia gerada pela degradação de moléculas complexas ocorre em três estágios:

7. 1° estágio – Hidrólise de moléculas complexas: As moléculas complexas são quebradas em seus blocos constitutivos. Por exemplo, proteínas são degradas em aminoácidos, polissacarídeos em monossacarídeos e lipídeos em ácidos graxos e glicerol. 2° estágio – Conversão dos blocos constitutivos em intermediários mais simples: Os blocos constitutivos diversos são posteriormente degradados em acetil-CoA e em umas poucas outras moléculas simples. Parte da energia é capturada como ATP, porém essa quantidade é pequena, comparada com a energia produzida durante o terceiro estágio do catabolismo. 3° estágio – Oxidação da acetil-CoA: o ciclo dos ácidos tricarboxílicosé a via final comum da oxidação de moléculas combustíveis, como a acetil-CoA. Grandes quantidades de ATP são geradas na fosforilação oxidativa, a medida que elétrons fluem de NADH e do FADH2 para o oxigênio.

8. Vias metabólicas utilizadas pelos microrganismos • Os microrganismos utilizam três vias metabólicas distintas para a quebra dos carboidratos: • O mecanismo glicolítico ou de Embden-Meyerhof é a via pela qual a maioria dos microrganismos realiza a quebra da glicose. Glicólise ou Via de Embden-Meyerhof Mecanismo de Entner-Doudoroff Via das Pentose-fosfatos

9. Glicólise ou via de Embden-Meyerhof A glicólise é o centro do metabolismo dos carboidratos, pois praticamente todos os glicídeos podem ser convertidos em glicose, tendo como produto final o piruvato. Na atualidade podemos definir a glicólise como a seqüência de reações que converte a glicose em piruvato, havendo a produção de energia na forma de ATP.

10. Reações da glicólise A conversão de glicose em piruvato acontece em duas partes principais: 1 - Ativação ou fosforilação da glicose: as cinco primeiras reações da glicólise correspondem a uma fase de investimento de energia, na qual as formas fosforiladas dos intermediários são sintetizadas a custa de gasto de ATP. 2 - Transformação do gliceraldeído em piruvato: as reações subseqüentes da glicólise constituem uma fase de produção de energia, na qual ocorre uma produção líquida de duas moléculas de ATP por molécula de glicose metabolizada.

11. A primeira fase termina com a formação do gliceraldeído-3-fosfato A segunda fase termina com a formação do piruvato

12. Reações da glicólise • Primeira parte  Ativação ou fosforilação da glicose • 1.1 - Fosforilação do açúcar • A glicose é uma molécula quimicamente inerte, assim para se iniciar a sua degradação é necessário que seja ativada. Depois de entrar na célula a glicose é fosforilada pela hexocinase produzindo Glicose-6-P pela transferência do fosfato terminal do ATP para o grupo hidroxila da glicose. Consumo de 1 molécula de ATP

13. Reações da glicólise • Primeira parte  Ativação ou fosforilação da glicose • 1.2 - Isomerização da glicose-6-P • A isomerização da glicose-6-P, com produção de frutose-6-P, é catalisada pela fosfoglicose-isomerase.

14. Reações da glicólise • Primeira parte  Ativação ou fosforilação da glicose • 1.3 - Fosforilação da frutose-6-P • A reação irreversível de fosforilação, catalisada pela fosfofructocinase, é o mais importante ponto de controle e o passo limitante da velocidade da glicólise. Consumo de 1 molécula de ATP

15. Reações da glicólise • Primeira parte  Ativação ou fosforilação da glicose • 1.4 - Clivagem da frutose-1,6-bifosfato • A aldolase cliva a frutose-1,6-bifosfato, dando diidroxiacetona-fosfato e gliceraldeído-3-fosfato. A reação é reversível e não regulada. A Frutose 1,6-bifosfato é dividida pela aldoase em duas trioses fosfatadas ficando cada uma com um fosfato.

16. Reações da glicólise • Primeira parte  Ativação ou fosforilação da glicose • 1.5 - Isomerização da diidroxiacetona-fosfato • A triose-fosfato-isomerase interconverte essas duas trioses. A diidroxiacetona-fosfato isomeriza, dando gliceraldeído-3-fosfato, para um posterior metabolismo pela via glicolítica. Essa isomerização resulta na produção líquida de duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato pelos produtos da clivagem da frutose-1,6-bifosfato. • A aldoase e a isomerase estabelecem equilíbrio. Só o gliceraldeído é substrato das reacções seguintes, por isso o isomero assegura que todos os 6 carbonos derivados da glicose podem prosseguir na via glicolítica.

17. Reações da glicólise • Segunda parte  Transformação do gliceraldeído em piruvato • 2.1 - Oxidação do gliceraldeído-3-fosfato • A conversão do gliceraldeído-3-fosfato em 1,3-bisfosfoglicerato pela gliceraldaído-3-fosfato-desidrogenase é a primeira reação de oxirredução da glicólise.

18. Reações da glicólise • Segunda parte  Transformação do gliceraldeído em piruvato • 2.2 - Síntese do 3-fosfoglicerato, com produção de ATP • Quando o 1,3-bisfosfoglicerato é convertido em 3-fosfoglicerato, o grupo fosfato de alta energia do 1,3-BPG é utilizado na síntese de ATP a partir do ADP. Essa reação é catalisada pela fosfoglicerato-cinase. Geração de 2 moléculas de ATP

19. Reações da glicólise • Segunda parte  Transformação do gliceraldeído em piruvato • 2.3 - Troca do fosfato do carbono 3 para o carbono 2 • A troca do fosfato do carbono 3 para o carbono 2 do fosfoglicerato pela fosfoglicerato-mutase (mutase: pois muda o grupo fosfato de posição dentro da molécula) é livremente reversível.

20. Reações da glicólise • Segunda parte  Transformação do gliceraldeído em piruvato • 2.4 - Desidratação do 2-fosfoglicerato • A desidrogenação do 2-fosfoglicerato pela enolase redistribui a energia dentro da molécula do 2-fosfoglicerato, resultando na formação do fosfoenolpiruvato, que contem um enol fosfato de alta energia.

21. Reações da glicólise • Segunda parte  Transformação do gliceraldeído em piruvato • 2.5 - Formação do piruvato, com produção de ATP • É a última reação a conversão do fosfoenolpiruvato em piruvato e esta é catalisada pela piruvato-cinase. Ocorre a transferência do grupo fosfato da molécula de fosfoenolpiruvato para o ADP, formando assim o ATP. Geração de 2 moléculas de ATP

22. Via das pentose-fosfatos • A via das pentoses é uma via alternativa de oxidação da glicose que leva a produção de 3 compostos: • ribulose-5-fosfato • CO2, • NADPH • É uma via independente da glicólise. • Na via das pentoses são produzidos vários açúcares fosforilados, com um número variável de átomos de carbono. • A energia vinda da oxidação da glicose é armazenada sob a forma de NADPH e não de ATP como na glicólise. • Alguns microrganismos como Thiobacillusnovellus e Brucellaabortus são deficientes em enzimas chaves dos processos glicolíticos e Enter-Doudoroff, entretanto crescem em meio de glicose. Essas bactérias utilizam-se do ciclo das pentoses, desviando gliceraldeído-3P para oxidação até piruvato.

23. Reações da via das pentoses • As reações da via das pentoses compreende duas fases: • Fase oxidativa: • A glicose-6-fosfato é convertida a ribulose-5-fosfato e CO2 por duas oxidações intercaladas por uma reação de hidrólise. • Ocorre no sentido da conversão de NADP e NADPH. • É irreversível. • Fase não oxidativa: • A ribulose-5-fosfato é transformada em ribose-5-fosfato pela ação de uma isomerase. • Esta pentose sofre várias conversões gerando açúcares fosforilados com n° variado de carbonos. • É reversível, permitindo que ocorra interconversão entre diferentes açúcares.

24. Reações da via das pentoses Fase oxidativa – Conversão de hexose a pentose Primeira reação: A glicose-6-P é primeiro oxidada no seu carbono 1, dando origem a uma lactona (um ácido carboxílico cíclico). Os elétrons libertados são utilizados para reduzir uma molécula de NADP+. O anel é então aberto por reação com água. 6-fosfogliconolactonase Glicose-6-P 1-desidrogenase

25. Reações da via das pentoses Fase oxidativa – Conversão de hexose a pentose Segunda reação: A descarboxilação do gluconato liberta dois elétrons, que vão reduzir outra molécula de NADP+. Obtém-se assim um açúcar de 5 carbonos, a ribulose-5-fosfato, que por isomerização é transformado em ribose-5-P. Na figura assinalam-se em verde as diferenças entre os isômeros. Ribose-5-P epimerase Fosfo-gliconatodesidrogenase Ribulose-P 3-isomerase

26. Reações da via das pentoses Fase não oxidativa – Distribuição de carbonos O que ocorre a seguir depende das necessidades da célula: se a célula só precisar de NADPH e não precisar de ribose-5-P esta poderá ser reaproveitada. Isto ocorre através de 3 reações. Primeira reação: a ribose-5-P recebe dois carbonos da xilulose-5-P (obtida por epimerização da ribulose-5-P), formando a sedoeptulose-7-P e o gliceraldeído-3-P. Reação catalisada pela transcetolase.

27. Reações da via das pentoses Fase não oxidativa – Distribuição de carbonos Segunda reação: são transferidos três carbonos da sedoeptulose-7-P para o gliceraldeído-3-P, formando frutose-6-P e eritrose-4-P. Reação catalisada pela transaldolase.

28. Reações da via das pentoses Fase não oxidativa – Distribuição de carbonos Terceira reação: Por transferência de dois carbonos da xilulose-5-P para a eritrose-4-P, forma-se outra molécula de frutose-6-P e uma molécula de gliceraldeído-3-P. Reação catalisada pela transcetolase.

29. Reações não-oxidativas da via das pentoses Açúcares com vários n° de carbonos. Note o rearranjo de carbonos: 5C + 5C  3C + 7C  6C + 4C

30. Mecanismo de Entner-Doudoroff • A via de Entner-Doudoroff descreve uma série de reações alternativas que catabolizam a glicose até piruvato utilizando enzimas distintas das utilizadas na glicólise e na via da pentose-fosfato. • O mecanismos de Entner-Doudoroff é utilizado por um grande número de bactérias gram negativas como por exemplo: • Pseudomonas; • Azotobacter; • Rhizobium, • Agrobacterium; • Escherichiacoli; • Enterococcusfaecalis; • Zymomonasmobilis; • Xanthomonascampestris. • Os microrganismos que utilizam a via de Entner-Doudoroff não apresentam fosfoquinase-1 e por isso não podem converter frutose-6-fosfato em frutose-1,6-bifosfato.

31. Reações do Mecanismo de Entner-Doudoroff Inicialmente, a glicose-6-fosfato é transformada em ácido 6-fosfogluconato pela 6-fosfogluconatodesidrogenase. O 6-fosfogluconato é transformado em 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato pela 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconatoaldolase obtendo-se uma molécula de piruvato e uma de gliceraldeído-3P. O gliceraldeído-3P é oxidado a piruvato pelo processo da via glicolítica.