Bazotest – laboratorní provedení s použitím soupravy firmy Bühlmann Laboratories

1. Bazotest – laboratorní provedení s použitím soupravy firmy BühlmannLaboratories J. Havlasová, T. Sýkora InterImun Pardubice

2. Testy založené na měření aktivace bazofilů –provokační testy in vitro : exprese aktivačních znaků na membráně bazofilůměřená průtokovou cytometrií (BAT, BasophilActivation Test) BASOTEST (1997), Glycotope Biotechnology GmbH (dříve OrpegenPharma), Německo Flow CAST (2002), Flow2 CAST (2007), BühlmannLaboratories test uvolnění histaminu (HRT, Histamine Release Test) syntéza a uvolnění sulfidoleukotrienů (CAST-2000 ELISA, CellularAllergenStimulation Test, BühlmannLaboratories)

3. Předpoklady k zařazení testu do rutinní klinické diagnostiky: jednoduché a standardní provedení přínos pro klinickou praxi

4. inkubace plné krve pacienta s alergenem (ve stimulačním pufru) a značení pomocí monoklonálních protilátek lýza erytrocytů promytí vzorku měření na průtokovém cytometru cca 60 min do získání výsledku existují různé protokoly BAT (plná krev x separované leukocyty) komerční kitFlow 2 CAST, BühlmannLaboratories, Švýcarsko: provedení testu

5. standardizované alergeny určené pro in vitrotesty: hmyzí jedy léky (ATB, analgetika, anestetika/myorelaxancia) potravinová aditiva alergeny pracovního prostředí potravinové alergeny inhalační alergeny (pyly trav, plevelů a stromů, plísně, roztoči, epitelie) cca 120 alergenů www.buhlmannlabs.ch optimalizované koncentrace jednotlivých alergenů provedení testu - spektrum alergenů

6. Preanalytické požadavky minimální množství vzorku (2ml - 15 alergenů) plná krev (aktivace buněk v jejich přirozeném prostředí, bez nevýhod separace) zkumavka s EDTA (2ml), naplněná vzorkem  z poloviny (vyšší koncentrace EDTA – falešně negativní výsledky) skladování a transport vzorků (funkční test, životaschopné buňky) vzorek se po odběru uchovává při 2-8°C test je optimální provést v den odběru (riziko falešně negativních výsledků) načasování odběru odběr provést před zahájením kožních nebo provokačních testů 6 týdnů -12 měsíců po akutní alergické reakci minimálně 24 hodin před odběrem vysadit celkově podávaná antihistaminika, glukokortikoidy a kromony provedení testu – preanalytické požadavky

7. Hodnocení výsledků testu Identifikace populace bazofilů ve vzorku: CCR3 (bazofily 20 000 kopií, mastocyty, eosinofily, Th2 T lymfo) IgE, CD203c, CRTH2(DP2) minimálně 200 bazofilů (40 – 100 000 leukocytů) A CCR3-PE SS provedení testu – hodnocení výsledků

8. Procentuální zastoupení aktivovaných bazofilů: CD63 (1991) exprimován na membráně cytoplazmatických granulí klidových buněk, po aktivaci, degranulaci extracelulárně CD203c – 1999, CD13, CD164, CD107a A: I3/vosa 93,4% A CCR3-PE CD63-FITC SS CCR3-PE provedení testu – hodnocení výsledků

9. Procentuální zastoupení aktivovaných bazofilů: Normální hodnoty Flow 2 CAST: Inhalační a potravinové alergeny  15% Hmyzí jedy a latex  10% Léky, potravinová aditiva  5% (SI  2 ) vyšší % aktivace ?=?? závažnější alergická reakce provedení testu – hodnocení výsledků

10. Součástí testu jsou kontroly negativní kontrola (pozadí, bez stimulace,  5% CD63+) Stimulační index SI = % CD63+ bazofilů po stimulaci alergenem/ % CD63+ bazofilů ve vzorku bez stimulace pozitivní kontroly ( 10% CD63+) stimulace anti-FcRI (3% - 15% nonresponders) fMLP(chemotaktický tripeptid N-formyl-methionyl- leucyl-phenylalanin) A: A: A: negativní kontrola anti-FcεRI fMLP 4,9% 90,1% 38,1% CD63-FITC CD63-FITC CD63-FITC CCR3-PE CCR3-PE CCR3-PE provedení testu

11. Souhrn k provedení testu jednoduché provedení, rychlé získání výsledku k dispozici standardizované alergeny minimální množství vzorku zacházení po odběru obvyklé pro funkční testy komerční kit (CE) standardizace, reprodukovatelnost výsledků cena kumulace odběrů doporučeno používat čerstvě naředěné testovací alergeny (1 dávka určená pro vyšetření 4 pacientů) - připravujeme objednávací systém výjimka jed včely a vosy – lze testovat jednotlivě z organizačních důvodů (měření v den odběru) 1 den v týdnu (středy) provedení testu - shrnutí

12. Předpoklady k zařazení testu do rutinní klinické diagnostiky: jednoduché a standardní provedení přínos pro klinickou praxi

13. Bazotest v diagnostice alergie na hmyzí jed diskrepance mezi klinickým nálezem výsledky kožních testů výsledkem stanovení sp. IgE u 2/3 nejednoznačných výsledků může pomoci BAT (senzitivita a specifita 85-90%) pouze u 55% pacientů byla v souladu historie (reakce na bodnutí konkrétním druhem hmyzu) s odpovídajícím jednoznačně pozitivním sp. IgE i kožním testem (Ebo a kol., 2007) hlavní přínos BAT – může potvrdit klinický nález u pacientů s negativním kožním testem i sp. IgE (5-10% pacientů s anafylaktickou reakcí v anamnéze) přínos pro klinickou praxi

14. Bazotest v diagnostice alergie na hmyzí jed dvojitá pozitivita sp. IgE - včela i vosa 30-40 (50)% pacientů s alergickou reakcí na hmyzí bodnutí 2 skupiny pacientů: klinicky relevantní senzibilizace jedem včely i vosy (reakce nastane po bodnutí oběma druhy hmyzu) alergická reakce nastane jen u bodnutí jedním druhem hmyzu, druhá pozitivita je dána pouze sp. IgE proti „CCD“ (Cross-reactiveCarbohydrateDeterminants) klinicky irelevantní, in vitro fenomén vhodné odlišit při volbě alergenu pro SIT CAST testy (CAST ELISA, BAT) představují v současné době nejlepší nástroj pro určení druhu hmyzu který vyvolá klinické příznaky přínos pro klinickou praxi

15. CCD (Cross-reactiveCarbohydrateDeterminants) součást oligosacharidových řetězců glykoproteinů různých druhů hmyzu a rostlin 2 pro člověka cizorodé strukturální motivy – fukóza a xylóza společné pro alergeny z taxonomicky odlišných zdrojů (hmyzí jed, potravinové alergeny rostl. původu, latex, pyly) u hmyzího jedu je nejvýznamnějším alergenem exprimujícím CCD hyaluronidáza rostlinný N-glykan N-glykan hmyzího jedu přínos pro klinickou praxi

16. CCD (Cross-reactiveCarbohydrateDeterminants) pro člověka nejen cizorodé, ale zároveň silně imunogenní cca 20% alergických pacientů tvoří sp. IgE proti CCD IgE protilátky proti CCD jsou neškodné (pacient který má pouze tyto protilátky nemá klinické příznaky) přínos pro klinickou praxi

17. CCD (Cross-reactiveCarbohydrateDeterminants) Hypotéza o příčině neškodnosti těchto protilátek cukerný řetězec obsahuje pouze jedno vazebné místo pro protilátku (celý glykoprotein pravděpodobně pouze 1 CCD) Pro efektivní přemostění IgE receptorů na bazofilech/mastocytech (aktivace, degranulace) je třeba multivalentní (minimálně divalentní) alergen. rostlinný N-glykan přínos pro klinickou praxi

18. dvojitá pozitivita sp. IgE - včela i vosa Proč testy aktivace bazofilů tak výborně korelují s přítomností klinicky relevantní senzibilizace (konkrétním druhem hmyzu)? Testy aktivace bazofilů nutné přemostění receptorů na povrchu buněk Stanovení koncentrace sp. IgE dostačuje monovalentní vazba alergenu proto test prokazuje i klinicky irelevantní protilátky proti CCD Abbas, A.K., Lichtman, A.H. Cellular and Molecular Immunology

19. Testy aktivace bazofilů mohou pomoci určit klinický význam pozitivního nálezu sp. IgE v řadě dalších situací kdy v úvahu připadá přítomnost protilátek proti CCD: falešně pozitivní sp. IgE proti latexu (u polinotiků) u 90% pacientů s pozitivním sp. IgE a negativním kožním testem i klinickou anamnézou byl BAT na latex negativní (Ebo 2002) falešně pozitivní sp.IgE proti pylu trav, stromů a plevelů u 16% pacientů s alergií na hmyzí jed (n=259) (negativní SPT a anamnéza pylové alergie), prokázány protilátky proti CCD (Kochuyt 2005)

20. Závěr Díky relativně jednoduchému protokolu a letitým zkušenostem zdokumentovaným v odborných publikacích (hranice pozitivity, vhodné koncentrace alergenů atd.) je test připraven k zavedení do rutinní laboratorní diagnostiky. Nároky na preanalytickou fázi jsou srovnatelné s jinými funkčními testy. Test je obecně prezentován jako komplementární k dosud užívaným testům. I přes existenci kritických hlasů v recentní literatuře převažuje názor o jeho pozitivním přínosu v celé řadě klinických indikací. Celosvětově probíhající multicentrické studie zřejmě v blízké budoucnosti dále upřesní způsob jeho zařazení do vyšetřovacích algoritmů u alergií na jednotlivé typy alergenů.

21. Děkuji za pozornost.