Mecanismos de virulência em bactérias

1. Mecanismos de virulência em bactérias Bactérias patogênicas possuem um vasto arsenal de organelas de superfície e de moléculas com atividade tóxica para o hospedeiro conquista e ocupação de diferentes nichos, no curso da infecção Ferramentas para a aderência, colonização e invasão : moléculas proteicas monoméricas e complexos multiméricos que realizam funções altamente sofisticadas – verdadeiras nanomáquinas...

2. 1. Aderência às mucosas > colonização > elaboração de toxinas Aderência; multiplicação local e colonização – microcolonias, biofilmes, quorum-sensing; elaboração de toxinas; 2. Aderência às mucosas > penetração > multiplicação local ou invasão sistêmica invasão de superfícies epiteliais, endoteliais ou tecidos; sobrevivência intracelular

3. Aderência bacteriana a células – observação por microscopia de imunofluorescência

4. Estratégias bacterianas para aderir a células do hospedeiro Pili e fímbrias – organelas proteicas, projetam-se da superfície bacteriana inicialmente descritas em bactérias Gram-negativas distinção sutil entre pili e fímbrias – organelas dedicadas exclusivamente a aderência organização geral : haste cilíndrica ancorada a membrana externa, com região diferenciada na extremidade distal, a adesina, dedicada a ligação com um receptor celular

5. Fimbria P ou Pap (pyelonephritis-associated pilus) Escherichia coli uropatogenicas envolvidas em lesão renal (pielonefrite)

6. Aderência bacteriana via fímbrias – etapas do processo

7. Codificação dos genes da fímbria Pap - cluster gênico conjunto de genes regulatórios e biossintéticos: coordenam a síntese das subunidades da fimbria, chaperoninas e proteinas de ancoragem (usher) na membrana externa biogênese pela via “chaperonina-usher” a chaperonina periplasmica PapD transporta as subunidades da plataforma de montagem situada na membrana externa (PapC) esta plataforma facilita a translocação para a superfície bacteriana das subunidades formadoras da fimbria (haste e adesina distal – PapG)

8. biogênese da fimbria Pap

9. Fimbria tipo 1 – outra fimbria encontrada em E. coli saprófitas e em cepas patogênicas, inclusive UPEC associadas a infecções urinárias baixas

10. Adesinas não fimbriais são produzidas por bactérias Gram-negativas e Gram-positivas Pili tipo IV apresentam grande interesse - encontrados em bactérias Gram–negativas patogênicas Escherichia coli enteropatogenica, Salmonella Typhi, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio cholerae

11. Pili tipo IV de Vibrio cholerae (TCP) – apresenta-se como feixes de fibrilas; permite ligações laterais, formando agregados bacterianos nas mucosas

12. Escherichia coli enteropatogênicas também produzem pili tipo IV (BFP) - microcolônias sobre células epiteliais cultivadas in vitro , observadas em microscopia convencional e eletrônica

13. Adesinas em bactérias Gram-positivas • predominam adesinas não-fimbriais: • Clostridium perfringens, Actinomyces, Streptococcus agalactiae, S. mutans, S. pneumoniae, Staphylococcus aureus • interações com proteinas da matriz extracelular (colágenos, lamininas, elastina, hialuranos) e glicoproteinas (fibronectina, vitronectina, fibrinogênio) • ligação direta às proteínas • exploração da capacidade de ligação da proteina (especialmente fibronectina) a outros substratos (células, tecidos) • enorme capacidade de modulação da atividade adesiva

14. Estratégias de bloqueio da aderência bacteriana

15. Quorum-sensing sistemas que regulam a expressão de genes em função da densidade bacteriana local mecanismo geral das bactérias em patógenos – opera na regulação da expressão de genes de virulência: produção de toxinas, enzimas líticas, biofilmes, estruturas de superfície etc. molécula autoindutora, secretada pela bactéria e receptor intracelular o receptor intracelular, ativado pela ligação com a molécula autoindutora, atua sobre o gene promotor do gene de virulência, levando à sua expressão

16. Com o aumento da densidade bacteriana, aumenta a concentração do autoindutor e a saturação dos receptores; estes se ativam totalmente e induzem a regulação positiva (transcrição) de genes de virulência – proteases, toxinas, fimbrias, biofilme etc.

17. Mecanismos de quorum-sensing em Pseudomonas aeruginosa

18. Produção de toxinas Estratégias de bloqueio do QS – (i) inibidores da ligação autoindutor-receptor ou (ii) inibição da síntese do autoindutor

19. Toxinas bacterianas 1880 – filtrados de culturas de Corynebacterium diphteriae reproduziam a doença em animais exotoxinas – proteínas ou peptídeos, são secretadas e interagem com receptores específicos, nas células-alvo exotoxinas AB – região catalítica (A) e região de ligação ao receptor celular (B) em alguns casos, a toxina secretada requer digestão proteolítica no ambiente, para ser ativa – botulismo alvos das exotoxinas AB: inibição de síntese protéica, interferência na transdução de sinais, ação sobre a polimerização de actina, ação sobre o tráfego de vesículas endossomicas

20. Exemplo de exotoxina AB – toxina Shiga de Escherichia coli enterohemorrágica Interrupção da síntese protéica na célula-alvo pela clivagem enzimática e remoção de um nucleotídeo (adenina) do RNA 28S do ribossoma, impedindo a sua interação com os fatores de alongamento 1 e 2

21. Outras exotoxinas: • toxinas ativas em membranas: • não penetram nas células ou possuem domínios catalíticos • principais famílias: • formadoras de poros – citolisinas • termo-estáveis – ligam-se a receptores e estimulam cascatas de transdução de sinais • superantígenos – ligam um componente do complexo principal de histocompatibilidade a receptores de linfócitos T, promovendo interação independente do antígeno e determinando a estimulação policlonal dos linfócitos.

22. Os quatro principais grupos de exotoxinas bacterianas

23. Endotoxinas natureza lipopolissacarídica – LPS (porção lipídica) são liberadas pela lise bacteriana interagem com receptores em inúmeras células: macrófagos, linfócitos B, células endoteliais etc. determinam a liberação de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, TNF-alfa, IL-6, prostaglandinas A liberação maciça de LPS: ativa o complemento, causa hipotensão, vasodilatação e choque, determina hemorragias nos capilares, ativa a cascata da coagulação - coagulação intravascular disseminada

24. Produção de toxinas exotoxinas e endotoxinas

25. Invasinas 1) associação com integrinas e internalização integrinas e caderinas – transmitem sinais bioquímicos e força mecânica entre a membrana celular e o citoesqueleto de actina microrganismos que ligam-se a estas moléculas podem explorar as suas propriedades – internalização alvo mais comum – integrinas da classe alfa5 beta 1 embebidas na membrana celular, estas proteínas transmembrana estabelecem ligações com a matriz extracelular, ligando-se a fibronectina

26. Matriz extracelular tração citoplasma Integrina – molécula transmembrana, conecta o citoesqueleto a matriz extracelular

27. invasina de Yersinia enterocolitica intimina de Escherichia coli enteropatogênica possuem alta afinidade por integrinas - simulam a estrutura das fibronectinas ocorrendo a interação invasina-integrina, a região citoplasmática da integrina recruta componentes que operam como sítios de ligação para proteínas associadas ao citoesqueleto a) ativação da cinase FAK b) ativação de proteínas reguladoras de actina: GTPases como Rac1 e Arf6 c) produção local de fosfatidilinositol 4,5 difosfato, mensageiro secundário que determina a ativação e localização de moléculas reguladoras de actina

28. bactéria invasina Bactéria com invasina tração citoplasma Integrina – molécula transmembrana, conecta o citoesqueleto a matriz extracelular

29. Invasão de célula epitelial por Yersinia enterocolitica – ligação entre invasina e integrinas; a força mecânica gerada promove a entrada da bactéria

30. tração E-caderina – ligação entre células vizinhas (junções oclusivas) Listeria monocytogenes interage com a caderina e sofre internalização

31. 2) Sistema de secreção tipo 3 e invasão a montagem do SST3 é estimulada pelo contato com a membrana da célula-alvo cluster de genes responsáveis pela síntese de: a) cerca de 20 proteínas estruturais participam da formação de uma agulha (ou injetissoma) que atravessa a parede celular bacteriana e a membrana plasmática da célula-alvo; b) chaperoninas – proteínas especializadas, servem como molde para a dobradura de subunidades proteicas, protegendo-as da degradação ou oligomerização prematura; c) proteínas efetoras, injetadas na célula-alvo; d) proteínas reguladoras da atividade do SST3

32. Diagrama e imagens ao microscopio eletrônico do SST3 ; organização dos genes em uma ilha de patogenicidade

33. Proteinas efetoras são translocadas por um SST3 e exercem várias funções: ativação de GTPases, modulação do metabolismo do inositol-polifosfato, despolimerização da cofilina – resulta em mobilização local da membrana (ruffling) e internalização bacteriana

34. Estudos in vitro empregando a infecção de células epiteliais vem decifrando a dinâmica em tempo real da atividade das moléculas efetoras translocadas pelo SST3 em Salmonella enterica, a translocação é muito rápida; ocorre a partir de um “pool” de SipA pré-formado; todo o “pool” pode ser injetado entre 100-600 segundos em Shigella flexneri, os efetores IpaB e IpaC pré-sintetizados são mantidos em associação com chaperoninas; disponíveis para injeção imediatamente após o contato com a célula-alvo

35. Estratégias bacterianas para assegurar a infecção intracelular: • intralisossomal – em compartimentos acídicos e hidrolíticos que interagem com a rede endossomica da célula • Coxiella • intravacuolar – em vacúolos não acídicos que interagem pouco ou não interagem com a rede endossomica • Salmonella – remodela o fagossomo > ilha de patogenicidade • Mycobacterium – bloqueia a maturação do fagossomo • citoplasmática – o patógeno liberta-se do fagossoma e passa a residir no citoplasma • Shigella, Listeria, Riquétsias

36. Destino das bactérias intracelulares – sobrevivência e replicação

37. Espalhamento célula-célula de patógenos intracelulares: Shigella flexneri - microscopia eletrônica e microscopia de imunofluorescência Motilidade intracelular e passagem entre células através das membranas adjacentes