Intracellul áris / nu k l eá r is receptor jelátvitel

1. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

2. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Berki Tímea és Boldizsár Ferenc Jelátvitel Intracelluláris/nukleáris receptor jelátvitel

3. Történeti háttér • G.T. Beatson skót sebész inoperábilis emlőrák regresszióját írja le ovariektómia után • Az állatok kasztrációja javítja a hús minőségét • Ősi kínai orvoslás placenta extraktumot használ • 1926 Kendall ésReichstein kortizon és tiroxin • Butenandt/Doisy ösztrogén (terhes nő vizeletében) • Androszteronésprogeszteron (sertés corpusluteumból izolálták) • “estrus” ~ “oistros” (Greek) = bögöly • 1961 Jensen: ösztrogén receptor • 1980-as évek: ER, GR, TR klónozása (Chambon, Evans ésVennström)

4. Hatásmechanizmus • Nukleáris receptorok a sejtekben található fehérjék, amelyek a szteroid és thyroid hormonok és más lipofil molekulák érzékelését végzik • Ligand kötődése a nukleáris receptorhoz annak konformációváltozását idézi elő, amely aktiválódva, transzkripciós faktorként viselkedik • A receptor aktivációja gének átíródásánakfokozását vagy gátlását eredményezi.

5. Transzkripciósfaktorok • Transzkripciós faktorok: szekvencia-specifikus DNS-kötő faktorok • Szabályozzák a DNSgenetikai információjának átíródásátmRNS-re • Aktivátorként hatnak (= segítik a génexpressziót) vagyrepresszorok (= gátolják a génexpressziót) szabályozva az RNSpolimeráz toborzását

6. Transzkripciósfaktorok vizsgálata • Transzkripciósfaktor aktivitás: • Luciferázteszt • Kromatinimmunoprecipitáció (ChIP) • ElectrophoreticMobility Shift Assay (EMSA) • Transzkripciósfaktor interakció: • Ko-immunoprecipitáció

7. Luciferáz riporter assay • A célsejt transzfekciójaLuc Vectorral • A sejtek aktiválása • Signaling, TF aktiváció • Luciferáz szintézis • Fényelnyelődés mérése RNS polimeráz és transzkcripciós faktorok Promóter Reporter gén Transzkripció mRNS Transzláció Reporter fehérje

8. Ligandok • Lipofilhormonok: A keringésben transzport fehérjékhez kapcsolódnak;a plazmamembránon transzport fehérjéhez kötődve vagy passzívan lépnek át 17-b-ösztradiol Ösztrogén receptor (ER) Tesztoszteron Androgén receptor (AR) Kortizol Glükokortikoid receptor (GR) Trijódtironin (T3) Tiroid hormon receptor (TR) Kalcitriol D-vitamin receptor (VDR) A-vitamin Retinsav receptor (RAR)

9. A nukleáris receptorok faji megoszlása • A nukleáris receptorok állatokra jellemzőek, algákban, gombákban és növényekben nincsenek • AC. elegans-nak 270ismert receptora van • Számos orphan receptor létezik!!! • Az emberi nukleáris receptorok száma 48, egérben és patkányban 49 illetve 47 nukleáris receptort találtak

10. Intracelluláris receptorok

11. Nukleáris receptor családok Szteroid Recetorok RXR Heterodimerek GR MR PR AR T3R RAR VDR PPARa PPARg EcR FXR CAR LXR PXR/SXR Glükokortikoid Mineralokortikoid Progeszteron Androgén Tiroid hormon All-transzRA 1,2,5-(OH)2-VD Zsírsavak 15d-Δ12,14-PGJ Ekdizon Epesav Androsztán Oxiszterol Xenobiotikumok GR GR RXR R Dimer „Orphan”- ÁrvaReceptorok Monomer „Orphan” - Árva Receptorok RXR COUP HNF-4 TR2 TLX GCNF 9-cisz RA NGFI-B SF-1 Rev-erb ROR ERR RXR RXR RXR

12. A nukleáris receptorok szerkezeti felépítése Dimerizáció Hinge régió C-terminális domén N-terminális domén A/B C D E F 50-500 aminosav, variábilis Ligand-kötő domén (LBD) DNS-kötő domén (DBD) AF-1 AF-2 200-250 aminosav, mérsékelten konzervált 70 aminosav,konzervált AF-1: aktivációs funkció 1 (ligand-független) AF-2: aktivációs funkció 2 (ligand-függő)

13. A szteroid receptorok hatás-mechanizmusai Hormon Plazma membrán Citoplazma HSP RXR RXR GR GR GR GR GR RXR R GR RXR R HSP Ko-represszor Sejtmag Ko-aktivátor Ko-aktivátor Ko-aktivátor Ko-aktivátor Ko-aktivátor RNS polimeráz RNS polimeráz RNS polimeráz RNS polimeráz RNS polimeráz Ko-represszor HRE HRE HRE HRE Transzkripció Transzkripció Transzkripció

14. A GC hatás időbeli lefolyása Szabályozás szintjei Ezred- másodperc (?) Órák-napok Másodpercek -percek(?) CBG kötés a vérben MDR a membránban ? Molekulák találkozása Kötődés Metabolizmus és a nukleáris receptor sorsa ? TF-ok Ko-regulátorok Dimerizáció Sejtmag GRE Transzkripció Szteroid MR/GR

15. NR-ok típusai • I-típusú nukleáris receptorokhoz tartoznak a 3-as alcsoport receptorai, mint az androgén receptor, ösztrogén receptorok, glükokortikoid receptor és progeszteron receptor • II-típusú nukleáris receptorokhoz főleg az 1-es alcsoport tartozik, mint a retinsav receptor, retinoid X receptor és tiroid hormon receptor

16. I-típusú receptor hatás Hormon Plazma membrán Citoplazma HSP NR NR NR NR NR NR HSP Megváltozott sejtműködés Fehérje mRNS Sejtmag Ko-aktivátor Ko-aktivátor RNS polimeráz mRNS RNS polimeráz HRE Célgén

17. I-típusú NR jellemzői • Ligand hiányában a citoszolban találhatóak • Hormon kötődése a receptor disszociációját okozza a hősokkfehérjéről (Hsp), majd annak dimerizációja után a receptor nukleáris transzlokációját • A sejtmagban specifikus DNS szakaszokhoz (HormoneResponseElement, HRE) kapcsolódik • A NR-DNS komplex egyéb fehérjék toborzását indítja el, amelyek felelősek a transzkripció és új fehérjék transzlációjának elindításáért, amely végül a sejt funkciójának megváltozását eredményezi

18. A citoplazmatikusreceptor komplex • Hsp90, 70, 40 + ko-chaperone p23 + immunophilin(pl. FKBP52): dynein-hez (motorfehérje) kapcsolja a komplexet • Dinamikusösszekapcsolódás-szétkapcsolódás • Ligand-kötött receptorok a mikrotubulusok mentén transzportálódnak a nukleárispórusokhoz

19. II-típusú receptor hatás Hormon Plazma membrán Citoplazma RXR RXR TR TR Megváltozott sejtműködés Fehérje Ko-represszor mRNS Sejtmag Ko-represszor Ko-aktivátor Ko-aktivátor RSA polimeráz mRNS RNS polimeráz HRE HRE Célgén

20. II-típusúNR-ok • A ligand jelenlététől függetlenül a sejtmagban helyezkednek el, általában hetero-dimer formában (általában RXRel) kapcsolódnak a DNS-hez • Ligand hiányában a II-típusú nukleáris receptorok gyakran ko-represszor fehérjékkel kapcsolódnak

21. Nukleáris receptor heterodimer formája • PPRgamma (zöld) és RXR alpha (kék) kettősszálú DNS-sel komplexben (lila), NCOA2 ko-aktivátorpeptiddel (piros).

22. DNS kötés • DNS kötőhelyek (=Response Elements): • 2x6 bázispár • Szteroid rec. (homodimer): palindrom, invert ismétlődő szakaszok 3bp spacer-rel elválasztva (IR3) • GR, MR, PR, AR: 5’-AGAACA-3’ • ER: 5’-AGGTCA-3’ • Nem-szteroid rec.: 5’-AGGTCA-3’direkt ismétlődő szakaszok (DRn, n=spacerek száma) • homodimerek (pl. TR, VDR) • heterodimerek (pl. TR, VDR, RAR, LXR, FXR, PXR, CAR, PPAR)

23. A NR-okgenomikus hatása Ligand LBD RE DBD

24. A DNS-kötő domén(DBD) szerkezete • A humán progeszteron receptor DNS-kötő doménjénekdimerje (kék és zöld) és kettősszálú DNS (lila) komplexe. A cinkatomokat szürke pontok jelölik.

25. Gén szabályozás • Transzaktiváció: • Ligand-kötött receptorko-aktivátorokattoboroz →transzkripció aktiválása: interakció általános transzkripciósfaktorokkal + kromatinfelnyitása (ATP-dependenskromatin remodeling/hiszton acetiláció) • Ligand-kötés→ko-represszor disszociáció→ko-aktivátor kötése • Transrepresszió: • Ligand hiányában a transzkripció folyamatos, ligand-kötés gátolja a transzkripciót

26. Transzrepresszió – ligand szelektivitás • Bizonyos nukleáris receptorok nemcsak közvetlenül kapcsolódnak DNS szakaszokhoz, hanem képesek transzkripciós faktorokhoz is kötődni. Ez a kötődés általában a másik transzkripciós faktor inaktiválását eredményezi. • Bizonyos GR ligandok, un. szelektív glükokortikoid receptor agonisták (SEGRA-k) képesek a GR-t úgy aktiválni, hogy az erősebb transzrepressziós, mint transzaktivációs hatású • Ez a ligand-szelektivitás lehetővé teszi olyan ligandok kifejlesztését, amelyek erősebb gyulladásgátló hatásúak, kevesebb nemkívánatos metabolikus mellékhatást okozva

27. A NR-ok szabályozása • A transzkripciós aktivitás növelése: • Foszforiláció: • Ser maradványok az N-terminális A/B doménen • Ciklin-dependens kinázok • PKC, PKA • ERK • PKB/Akt • JNK/SAPK • p38-MAPK • AF-1: CDK, ERK, JNK, p38-MAPK, PKB • AF-2: Srcaz ER-nál

28. A NR-ok szabályozása A transzkripciós aktivitás gátlása: • A DNS-kötő domén (DBD) foszforilációjaPKC vagy PKA által

29. Terápiás lehetőségek – hormon analógok • Glükokortikoidok: anti-inflammatorikus, immunoszupresszív kezelések (pl. autoimmun betegségek, transzplantáció, egyesleukémiák) • Szexuál szteroidok: szubsztitúciósterápia (endokrin betegségek), fogamzásgátlás, emlőrák • Tiroxin: tiroidectomia után szubsztitúcióstherápia • A/D-vitamin deficiencia