MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE PARASITOSES

1. MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DE PARASITOSES

2. AMOSTRA • A amostra a ser colhida para o teste imunológico dependerá do sítio de infecção do parasita e do tipo de teste utilizado. • Ex.: soro, líquor, urina, fezes, tecidos etc. • Na maioria dos testes, trabalha-se com diluições (seriadas ou não) das amostras  títulos

4. REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO Formação de agregados visíveis como resultado da interação de Ac específicos e partículas insolúveis que contenham determinantes Ag em sua superfície. Pode ocorrer em: • partículas que apresentem Ag naturais de superfície (hemácias, bactérias, protozoários) – aglutinação direta • partículas inertes (látex) ou com células antigenicamente não relacionadas, às quais se adsorvem ou se fixam Ag solúveis – aglutinação indireta • Hemaglutinação • Aglutinação do látex

5. TESTE DE HEMAGLUTINAÇÃO • Testa Ac IgG e IgM • Hemácias de carneiro ou humanas do grupo O, fixadas com formaldeído ou glutaraldeído, sensibilizadas com o Ag (polissacarídicos ou protéicos) • Suspensão das hemácias em solução estabilizadora para evitar reações inespecíficas • Adição do soro em diluições progressivas

6. Teste positivo: formação de tapete Teste negativo: formação de botão

7. TESTE DE AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX • Usado na detecção de Ag ou Ac • Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser usadas como suportes na adsorção de proteína solúvel a Ag polissacarídeos

9. REAÇÃO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO A ligação Ag-Ac promove a fixação do complemento, cujo consumo (in vitro) pode ser empregado para detecção de Ac, Ag ou ambos. O teste é realizado em duas etapas: • fixação do complemento: Ag incubado com Ac na presença de uma quantidade definida de complemento. Se Ag e Ac correspondentes estiverem presentes, há ativação da cascata do complemento e haverá consumo do complemento • adição do revelador da reação: hemácias de carneiro sensibilizadas com hemolisina (Ac anti-hemácia de carneiro obtido em coelhos) A medida da atividade hemolítica do complemento no sistema indicador permite detectar a presença de Ag ou Ac na mistura inicial e sua quantidade.

10. 1. fixação do complemento 2. revelação da reação

11. TESTE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA Baseia-se na capacidade das moléculas de Ac se ligarem a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o Ag. Fluorocromos: substâncias que, quando excitadas com luz UV, absorvem luz de um comprimento de onda menor e, instantaneamente, emitem luz de comprimento de onda maior (fluorescência). • Teste de Imunofluorescência Direto: usado geralmente para detectar a presença do Ag em uma amostra clínica. • Teste Imunofluorescência Indireto: usado para detectar a presença, no soro, de Ac específicos.

13. Imunofluorescência Indireta (IFI)

14. A B IFI para T. gondii: (A) positivo e (B) negativo IFI positivo para T. cruzi

15. Ag IF positivo para G. duodenalis

16. TESTE DE ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay • reação Ag-Ac monitorada por medida da atividade enzimática (peroxidase). • leitura visual ou fotométrica, com substratos coloridos, fluorescentes ou luminescentes. • para a peroxidase o substrato é o H2O2 e os cromógenos: ortofenilenodiamina, ácido 5-amino salicílico, ortotoluidina etc , que serão oxidados originando um produto solúvel e colorido. ELISA Direto: detecta Ag ELISA Indireto: detecta Ac

17. ELISA indireto

18. ELISA direto (ELISA “sandwich”)

19. Interpretação dos resultados: • leitura visual • espectrofotômetro (absorbância)

20. PARÂMETROS SOROLÓGICOS

21. SENSIBILIDADE: porcentagem de resultados verdadeiramente positivos em indivíduos comprovadamente infectados • ESPECIFICIDADE: porcentagem de resultados verdadeiramente negativos em indivíduos comprovadamente sadios • EFICIÊNCIA: concordância dos resultados verdadeiros positivos e negativos em indivíduos com e sem infecção • VALOR PREDITIVO POSITIVO: probabilidade do resultado positivo ser verdadeiramente positivo • VALOR PREDITIVO NEGATIVO: probabilidade do resultado negativo ser verdadeiramente negativo

22. SENSIBILIDADE(S) = VP / total infectados ESPECIFICIDADE (E) = VN / total sadios EFICIÊNCIA (Ef) = VP + VN / total indivíduos VALOR PREDITIVO POSITIVO (VPP) = VP / total resultados positivos VALOR PREDITIVO NEGATIVO (VPN) = VN / total resultados negativos

23. Variação da sensibilidade e especificidade do teste de acordo com o cut-off

27. Influência da prevalência nos valores preditivos

28. Variação dos valores preditivos dependendo da prevalência

29. exercícios