É tude du déterminisme de maturation et d’infectiosité des virus des hépatites B et D

1. Étude du déterminisme de maturation et d’infectiosité des virus des hépatites B et D Laboratoire de virologie moléculaire Camille SUREAU Institut National de la Transfusion Sanguine PARIS

2. Le virus de l’hépatite B(HBV)

3. Généralités (i) • Plus de 350 millions de patients sont chroniquement infectés par HBV (OMS). • Il existe un vaccin efficace et sûr depuis 1984. 95% Guérison 70% Hépatite Aiguë Hépatite chronique Cirrhose Hépatocarcinome Infection Chronicité Porteurs sains 5% 30%

4. Généralités (ii) Hepadnaviridae Orthohepadnavirus HBV WMHBV GSHV WHV Avihepadnavirus DHBV HHBV

5. Les particules HBV Diamètre:42 à 46 nm Diamètre: 20 nm Longueur variable Diamètre: 20 nm 100 nm

6. Le virion mature: la particule de Dane

7. Le génome HBV • ADN circulaire partiellement bicaténaire • Organisation génétique très compacte: • tous les nucléotides sont codants • les ¾ sont inclus dans deux ORF • quatre ORF sont présentes • Sept protéines virales : • polymérase virale • protéine X (non structurale) • protéine de capside • protéine « e » (AgHBe) • trois protéines d’enveloppe

8. Le Cycle de réplication HBV

9. Les protéines d’enveloppe HBV

10. S-AgHBs • M-AgHBs La topologie des protéines d’enveloppe HBV

11. pre-S1 cytosolique • pre-S1 luminale La protéine L-AgHBs RE CI

12. Les fonctions des protéines d’enveloppe (i) • S- et L-AgHBs sont nécessaires à la maturation HBV • M-AgHBs n’a pas de rôle connu In vitro • S-AgHBs fournit le moteur du bourgeonnement

13. Les fonctions des protéines d’enveloppe (ii) L-AgHBs, par sa topologie pre-S cytosolique,permet lerecrutement de la nucléocapside HBV [Domaine matrice (92-à-113)].

14. Les fonctions des protéines d’enveloppe (iii) L-AgHBs, par sa topologiepre-S externe permet l’attachement au récepteur de la cellule cible (entrée virale).

15. Les fonctions des protéines d’enveloppe (iv) • Les protéines d’enveloppe HBV bourgeonnent spontanément dans la lumière du RE, principalement sous forme de PSV. • La nucléocapside HBV peut être recrutée pour former des virions matures. • Une autre structure virale peut être enveloppée. Il s’agit d’une structure ribonucléoprotéique appartenant au virus de l’hépatite delta.

16. Le virus de l’hépatite delta(HDV)

17. Généralités HDV est: • Un virus enveloppé à ARN (-) • Un virus défectif, satellite occasionnel d’HBV, qui requiert la présence des protéines d’enveloppe d’HBV pour accomplir son cycle infectieux • Le seul membre du genre Deltavirus

18. Le virion HDV

19. L’ARN HDV

20. Les protéines delta (AgHD) • S-AgHDstimule la réplication de l’ARN HDV • L-AgHDinhibe la réplication et dirige la maturation

21. Pol-II La réplication du génome HDV

22. Cycle de réplication HDV

23. Maturation HDV • S-AgHBs est suffisante pour la maturation HDV : • elle assure le bourgeonnement • elle possède un domaine matrice HDV • L-AgHBs est indispensable à l’entrée virale HDV car elle porte le domaine d’attachement au récepteur.

24. Travail de thèse

25. Objectifs de la recherche • Recherche dans les BCY-I et –II de: • déterminants de maturation HBV et HDV ? • déterminants d’infectiosité ? • Recherche dans le domaine pre-Sde L-AgHBs de: • déterminants d’infectiosité HDV ? (Comparaison avec les déterminants HBV)

26. HDV HBV HDV • Domaine matrice : • résidus 92 à 113 sur pre-S. • Bruss, V. (1997). J Virol 71, 9350-57. • Déterminant de maturation HBV: • résidus 35 à 59 et R79 de la BCY-I. • Loffler-Mary, H.,et coll.(2000). Virology 270, 358-67. • Domaine matrice : • W-196,-199,-201 BCY-II. • Jenna, S., et Sureau, C. (1999). J virol 73, 3351-58. • Komla-Soukha, I., et Sureau, C. (2006). J virol 80,4648- 55. La moitié C-terminale de BCY-I n’a pas été étudiée pour la maturation des virions car les grandes délétions sont délétères pour la stabilité des protéines. État des connaissances sur la maturation

27. État des connaissances sur l’entrée virale TLM • Déterminant d’infectiosité : • résidus 1 à 77 de pre-S1. • Le Seyec, J. et coll. (1999). J virol 73, 2052-57. • Myristate • Bruss, V. et coll (1996). Virology 218, 396-99. • Domaine d’attachement au récepteur : • résidus 2 et 48 de pre-S1. • Gripon, P. et coll. (2005). J virol 79, 1613-22. • Séquence TLM (résidus 149 à 160): • impliquée à l’entrée virale. • (Stoeckl, L. et coll., (2006). PNAS 103, 6730-34. • Boucle Antigénique : • impliquée à l’étape d’entrée virale. • Jaoudé, G. A., et Sureau, C. (2006). J virol 79, • 10460-66

28. 1ere Partie Déterminants de maturation et d’infectiosité HBV et HDV dans les BCY-I et –II

29. Création et criblage de mutations permissives pour la secrétion de PSV dans la BCY-I(démarche expérimentale) Pour l’étude de la maturation HBV et HDV, les mutations doivent être permissives pour la sécrétion de PSV. • Transfection de cellules Huh-7 avec: • pT7HB2.7 ou dérivé • Analyse à J4 des protéines d’enveloppe présentes dans les cellules et les surnageants par WB (anti-S + anti-pre-S2)

30. Mutants BCY-I

31. Quelles sont les mutations BCY-I permissives pourla secrétion de PSV? Mutants permissifs pour la sécrétion de PSV obtenus pour l’intégralité de la BCY-I.

32. La BCY-Iest-elle impliquée dans la maturation HBV? • Transfection de cellules Huh-7 avec: • pCIHBenv(-) • pT7HB2.7 ou dérivé • Analyse (J11) • ADN HBV • cellule • surnageant : IP anti-preS1 • protéines d’enveloppe • surnageant : ELISA anti-HBs Mutation permissive quand le rapport ADN viral / protéines d’enveloppe dans le surnageant est conservé.

33. La BCY-I ne contient pasde déterminant majeur de maturation HBV. La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HBV?

34. La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HDV ? (démarche expérimentale) • Transfection de cellules Huh-7 avec: • pSVLD3 • pT7HB2.7 ou dérivé • Analyse (J12) • ARN HDV (Cellules et surnageant) • protéine d’enveloppe (Surnageant) Mutation permissive quand le rapport ARN viral / protéines d’enveloppe dans le surnageant est conservé.

35. La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HDV? La BCY-I ne contient pas de déterminant majeur de maturation HDV.

36. La BCY-I a t-elle un rôle à l’entrée virale ? (modèle HDV)(démarche expérimentale) • Normalisation des surnageants (ARN HDV) • Inoculation de cellules HepaRG (16 h, PEG) • Détection de l’ARN HDV dans les cellules • 7 jours après inoculation Mutation permissive quand la concentration en ARN HDV dans les cellules est équivalente à celle observée pour le type sauvage.

37. La BCY-I a t-elle un rôle à l’entrée virale ? (modèle HDV) La BCY-I ne contient pas de déterminant majeur pour l’infectiosité HDV.

38. Les résidus Trp de la BCY-II sont-ils impliqués dans la maturation HBV ? Les résidus W-196, -199, -201 de la BCY-II ne sontpas nécessaires à la maturation HBV.

39. Les résidus Trp de la BCY-II ont-ils un rôle à l’étape d’entrée virale ? (modèle HBV)(démarche expérimentale) • Normalisation des surnageants (ADN HBV) (dilution en série) • Inoculation de cellules HepaRG (16 h, PEG) • Détection de l’ARNm HBV dans les cellules • 12 jours après inoculation Mutation permissive quand la concentration en ARNm HBV dans les cellules est équivalente à celle observée pour le type sauvage.

40. Les résidus Trp de la BCY-II ont-ils un rôle à l’étape d’entrée virale ? (modèle HBV) Les résidus W-196, -199, et -201 de la BCY-II ne sont pas nécessaires à l’infectiosité HBV.

41. Conclusion 1 • La BCY-I ne contient pasde déterminant dematuration ni d’infectiosité HBV ou HDV. (Résidus Asp-33;Cys-48,-65,-69,-76;Tyr-72;Arg-73 non testés car leur mutation n’est pas compatible avec la sécrétion des PSV) • Les Trp-196, -199, et -201, de la BCY-II n’ont pas de rôle dans la maturation et l’infectiosité HBV. Blanchet, M., et Sureau, C. (2006). J virol 80, 11935-45.

42. 2ème partie Déterminants d’infectiosité HDV et HBV dans le domaine pre-S de L-AgHBs.

43. Domaine matrice HBV (topologie interne) Domaine d’attachement 92 113 48 149 TLM 1 Extérieur 160 Membrane virale Démarche expérimentale • Production de virions HDV ou HBV exprimant L- et S-AgHBs (simplification du modèle par absence de M-AgHBs) • Analyse et normalisation des surnageants • Inoculation de cellules sensibles HepaRG ou de cultures primaires d’hépatocytes humains • Recherche d’ARN HDV ou d’ARNm HBV dans les cellules inoculées

44. DA DM TLM Extérieur Membrane virale Mutants pre-S

45. DA DM TLM Extérieur Production des virions HDV 110 Les mutations sont permissives pour la production de virions HDV.

46. Le domaine pre-S1 contient-il des déterminants d’entrée virale HDV ? (cellules HepaRG) • Les résidus 11 à 75 sont impliqués dans l’infectiosité HDV. • Les résidus 76 à 110 (contenant le DM) ne sont pas impliqués dans l’infectiosité HDV. DA DM TLM 110 Extérieur

47. DA DM TLM Extérieur La suppression du TLM n’est pas délétère pour l’infection en présence de PEG. Le PEG a t-il compensé une perte de fonction TLM? La suppression du TLM est-elle délétère à l’entrée virale ? (HDV/HepaRG/PEG)

48. La suppression du TLM est-elle délétère à l’entrée viraleen absence de PEG ? (HDV/HepaRG) DA DM La suppression du TLM n’est pasdélétère pour l’infection en absence de PEG. TLM Extérieur

49. Le TLM est-il nécessaire à l’entrée viraleen culture primaire d’hépatocytes ? DA DM TLM Extérieur La suppression du TLM n’est pas délétère pour l’infectiosité HDV en culture primaire d’hépatocytes.

50. La suppression du TLM est-elle délétère à l’entrée virale dans le modèle HBV ? (HepaRG) DA DM TLM Extérieur La suppression du TLM n’est pasdélétère pour l’infectiosité HBV en culture de cellule HepaRG.