CITOMETRIA DE FLUXO Aplicações práticas

1. CITOMETRIA DE FLUXOAplicações práticas Patrícia Cisneiros dos Santos Bióloga- UCSAL Mestranda do curso de Imunologia-UFBa

2. PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO CITO METRIA FLUXO Célula Medida Movimento Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

3. ANTICORPOS MONOCLONAIS

4. ANTICORPOS MONOCLONAIS

5. CITÔMETRO DE FLUXO CITÔMETRO DE FLUXO SISTEMA ÓTICO SISTEMA FLUIDO SISTEMA ELETRÔNICO

6. SISTEMA FLUIDO:INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO • SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ. • SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.

7. FOCO DO LASER SISTEMA FLUIDO CÂMARA DE FLUXO CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA

8. LaminarFlow Sheath Sheath FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH” HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE LOW DIFFERENTIAL PRESSURE High Sample Pressure60µl/min Low Sample Pressure12µl/min LaminarFlow Sheath Sheath Sample Sample

9. SISTEMA ÓPTICO • SISTEMA É COMPOSTO POR UMLASERE LENTESPARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER. • A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER. • UM SISTEMA DEESPELHOS ÓPTICOS EFILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS.

10. FlowCell FlowCell SISTEMA ÓTICO FACSCalibur FL1 530/30 SSC 488/10 FL2 585/42 90/10 Beam Splitter FL4 661/16 DM 560SP DM 640LP Half Mirror 670LP FluorescenceCollection Lens FL3 . Beam Combiner 488 nmBlue Laser FSC Diode Red Diode Laser~635 nm 488/10 FocusingLens

11. Filtros Ópticos – coletar sinais de luz Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu número é deixado passar e menor que seu número é refletido. Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu número é deixado passar e acima de seu número é refletido. Espelhos BP (bandpass) = só deixa passar o comprimento de onda específico. Longpass Shortpass Bandpass 460 500 540 460 500 540 460 500 540 Filtro LP 500 SP 500 BP500/30 Detector – célula fotoelétrica

12. ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC) LASER ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)

13. SISTEMA ELETRÔNICO • CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR.

14. SISTEMA ELETRÔNICO Amedida proveniente de cada detector é denominada Parâmetro • Parâmetro 1 FSC • Parâmetro 2 SSC • Parâmetro 3 FL1 • Parâmetro 4 FL2 • Parâmetro 5 FL3

15. O OH CO2H FLUORESCÊNCIA O que é a fluorescência ? Comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da luz do laser Fluoresceína  = 480 nm  = 530 nm Luz Fluorescente emitida de menor energia e maior comprimento de onda Luz Incidente de maior energía Fluorocromo

16. FLUORESCÊNCIAS • O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda  530 nm, que corresponde à luz verde. • O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda  570 nm, o que corresponde à luz laranja. • O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda  650 nm, o que corresponde à luz vermelha.

17. SISTEMA ELETRÔNICO

18. BLASTOS VOLUME (FS) POLIMORFONUCLEARES MONÓCITOS LINFÓCITOS DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS GRANULOSIDADE (SS) DISPERSÃO

19. 1000 800 Neutrófilos 600 Side Scatter 400 Monócitos 200 Linfócitos 0 0 200 400 600 800 1000 Forward Light Scatter DISPERSÃO:

20. DOT PLOT: FSC x SSC e FL1 x FL2 1000 1000 800 800 600 CD4 PE 600 SideScatter 400 400 200 200 0 0 0 200 400 600 800 1000 CD3 FITC 0 200 400 600 800 1000 Forward Light Scatter Visão dos dados coletados

21. ALGUNS MARCADORES CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos timócitos. CD4- 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas CD8- 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica. CD19- presente em mais de 95% das células B. CD20- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do tecido linfóide e sangue periférico. CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO. CD56- marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou granulócitos.

22. LEUCEMIAS CD3 CD7 HLA DR CD 42a CD 61 CD19 CD33 CD13 CD14 CD34 Leucemias mielóides CD10 CD2 CD20 CD3 CD7 CD19 CD22 CD23 CD26 CD5 Leucemias Linfociticas ou Enfermidade residual mínima CD3 CD7 CD2 CD19 CD5 CD56 Linfomas e Mielomas

23. APLICAÇÕES CLÍNICAS - Análise da subpopulação linfocítica - Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas - Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo - Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas - Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima - Análise de reticulócitos - Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna - Detecção de anticorpos antiplaquetários - Análise do conteúdo de DNA - Quantificação de células progenitoras (Stem cells) - Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusão linfocitária

24. OBRIGADA A TODOS! OBRIGADA A TODOS!