Lenka Brablcová, Iva Buriánková, Sang-Hoon Lee*, Do-Hyoun Kim* Jana Cupalová, Martin Rulík

1. Naše dosavadní výzkumy na toku Sitka prokázaly, že produkce metanu v sedimentech a jeho plynné emise do ovzduší jsou poměrně významné a nezanedbatelné z hlediska lokálních zdrojů skleníkových plynů. Protože o produkci metanu v tekoucích vodách existuje doposud minimum informací a o jeho spotřebě metanotrofními baktériemi pak prakticky nevíme vůbec nic, hlavním cílem této studie je detekce a zjištění diverzity jak metanogenních archeí, tak metanotrofních bakterií skupin I a II pomocí molekulárních technik zaměřených na PCR amplifikaci genů kódujících metyl koenzym M reduktázu (mcrA) u metanogenů a 16S rRNA (metanotrofové skupiny I a II). Tato studie je součástí projektu GAČR „Biogeochemie metanu a detekce metanogenních a metanotrofních bakterií v říčních sedimentech“, který bude řešen v příštích 4 letech. Vlastní experimentální postup byl založen na přímé extrakci DNA z přírodního vzorku, amplifikaci PCR, purifikaci PCR produktu, klonování do plazmidového vektoru, přenos na kompetentní buňky Escherichia coli a sekvenaci. Konstrukce a hodnocení kvality fylogenetického stromu (bootstrapping) a porovnání nalezených sekvencí se sekvencemi z databáze bylo provedeno pomocí programů RDP, CLUSTALLW a MEGA 4.0. V první fázi pokusů se nám zatím podařilo nalézt sekvenci, vykazující podle databáze RDP vysokou míru podobnosti s rodem Methylobacter, který je řazen do skupiny metanotrofů I. Analýza fylogenetického stromu potvrdila, že zmíněná bakteriální sekvence16S rRNA genu je úzce příbuzná rodu Methylobacter patřícímu do gammaproteobakterií. Tato sekvence byla získána přímou extrakcí DNA ze sedimentů z dolní části toku Sitka, které vykazují obecně nízkou metanotrofní aktivitu. Fylogenetická analýza metanogenních archeí a metanotrofních bakterií v hyporheickém sedimentu pomocí klonování a sekvenace genů mcrA a 16S rRNA genů KLONOVÁNÍ GENŮ Klonování genů patří mezi moderní a velmi perspektivní molekulární metody. Význam klonování spočívá v zisku čistého vzorku jednotlivého genu, odděleného od všech ostatních genů v buňce. Takto získaný čistý gen může být dále sekvenován (tj. určí se přesné pořadí nukleotidů v sekvenci) a porovnám s daty uloženými v mezinárodní bance klonů. Výsledkem je potom přiřazení klonu k již známým klonům (podle vzájemné podobnosti nukleotidových sekvencí) a vytvoření fylogenetického stromu. Vzhledem k faktu, že většina mikroorganismů pocházejících z environmentálního prostředí není běžnými metodami kultivovatelná, jeví se metoda klonování v oblasti mikrobiální ekologie vody obzvláště přínosná. Principem klonování genů je vytvoření mnoha kopií cílového genu díky přirozenému množení hostitelských buněk. Úsek DNA, který chceme klonovat, je vložen do kružnicové molekuly DNA zvané vektor - vzniká tzv. rekombinantní molekula DNA. Vektor je přenesen do hostitele (zpravidla bakterie), kde se pomnoží a produkuje velké množství vlastních kopíí a zároveň kopií genu, který nese. Množením hostitelských buněk se do dceřiných buněk přenáší i kopie rekombinantní DNA, kde opět dochází k replikaci. Po mnohonásobném dělení vzniká kolonie neboli klon identických hostitelských buněk. Každá buňka klonu obsahuje jednu nebo více kopií molekuly rekombinantní DNA - gen, nesený rekombinantní molekulou DNA, se pak nazývá klonovaný. Postup v jednotlivých krocích 1. PCR Díky polymerázové řetězové reakci (PCR) se cyklicky namnoží vybrané úseky vyizolované DNA. Selekce nukleotidové sekvence se provádí pomocí oligonukleotidového primeru (tj. krátký úsek uměle vyrobených nukleotidů). Primer nasedne na komplementární části řetězce DNA na obou protilehlých vláknech a tím ohraničí část DNA, která se bude dále amplifikovat. V našem případě byl použit primer vymezující sekvenci ribozomální DNA, typickou pro eubakteriální kmeny. Po mnohonásobné amplifikaci vybrané části genomu byla provedena kontrola za použití gelové elektroforézy. 2. Vložení PCR produktů do klonovacího vektoru Zpurifikované fragmenty DNA byly vloženy do plazmidových vektorů pUC8 (vznik tzv. rekombinantní DNA molekuly) a vektor transportován do hostitelské buňky E. coli (tzv. transformace). Tento způsob (horizontálního) přenosu genetické informace není v přírodě pravděpodobně běžným procesem. Bakteriální plazmidy (malé kruhové molekuly) obvykle nesou malé množství celkové DNA (cca 5%), která není pro základní životní pochody nezbytná, ale přináší obvykle jisté selektivní výhody - například rezistenci k antibiotiku. 4. Kultivace kompetentních buněk Vzorky kompetentních bakterií E.coli s plazmidy byly naneseny na agarovou plotnu a inkubovány přes noc. Následující den je nutné vybrané kolonie (nesoucí jeden klon) přeočkovat na čistou půdu. 5. Dvojí selekce K rozlišení kolonií, které jsou tvořeny transformovanými buňkami se používá systém dvojí selekce. Může se totiž stát, že bakterie nepřijmou nabízený plazmid nebo přijmou plazmid, který nenese náš segment DNA. Tato selekce je založena na dvojí kontrole, která se provádí na téže agarové plotně. První selekce spočívá v tom, že plazmid obsahuje gen Následovala purifikace získané DNA, díky které byly odstraněny zbytky chemikálií a nukleotidů. Lenka Brablcová, Iva Buriánková, Sang-Hoon Lee*, Do-Hyoun Kim* Jana Cupalová, Martin Rulík Katedra ekologie a životního prostředí PřF UP v Olomouci, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc, e-mail: formicula@email.cz, ivaburiankova@seznam.cz; * Department of Environmental Science, Hankuk University of Foreign Studies (HUFS), Mohyeon-myeon, Cheoin-gu, Yongin-si, Gyeonggi-do, 449-791, Korea 3. Příjem molekuly DNAkompetentní bakteriální buňkou Abychom zvýšili schopnost bakterií přijmout DNA, je nutné je chemicky i fyzikálně upravit. Buňky se připravují v roztoku solí (CaCl2) - tzv. kompetentní buňky a pohyb molekul DNA do nich je stimulován krátkodobým zvýšením teploty na 42˚C. k získání rezistence k antibiotiku, které se přidává do agaru, tzn. že vyrostou pouze kolonie bakterií, které plazmid přijaly. 6. Princip inzerční inaktivace genu lacZ’ Druhá kontrola je založena na principu narušení integrity určitého genu v klonovacím vektoru poté, co inkorporoval fragment DNA. Narušení integrity genu se projeví tím, že buňka přestane vykazovat nějakou vlastnost. Náš vektor pUC8 nese gen lacZ‘, kódující část enzymu β-galaktosidázy, který je běžnou součástí genetické výbavy E.coli a je nutný ke štěpení laktózy. Pro klonování je však použit modifikovaný bakteriální kmen, který postrádá právě tu část segmentu genu lacZ‘, která je nesena plazmidem. Takto modifikované kmeny mohou syntetizovat β-galaktosidázu pouze v případě, že přijmou plazmid. Agarová půda obsahuje analog laktózy (X-gal), který je rozkládán enzymem β-galaktosidázou za vzniku modrého barviva. Výsledkem tedy je, že na agarové plotně jsou kolonie bílé a modré. 7. Konstrukce fylogenetického stromu Výsledné nalezené sekvence patřící metanotrofům byly následně porovnány s databázemi klonových knihoven a dle míry podobnosti byl zkonstruován fylogenetický strom. Modré jsou tvořeny bakteriemi, které přijaly plazmid bez inkorporovaného segmentu DNA - nedošlo k porušení integrity genu lacZ‘, byla syntetizována β-galaktosidáza a štěpena laktóza za vzniku modrého barviva. Bílé kolonie představují bakterie, které přijaly plazmid s rekombinantní molekulou DNA, došlo tedy k narušení integrity genu lacZ‘ a nebyla syntetizována β-galaktosidáza ani štěpena laktóza. Bílé kolonie bakterií, nesoucí v plazmidech rekombinantní molekulu DNA, jsou potom cílové pro sekvenační analýzy. Tento systém se také nazývá modro/bílá selekce. Z kolonií, nesoucích zpravidla jeden typ klonu cílené sekvence, byla zpětně izolována plazmidová DNA a poslána do specializované firmy k sekvenaci. Fylogenetická pozice sekvence 16S rRNA genu (S15) získaná z hyporheického sedimentu toku Sitka. Použité obrázky pochází z knihy T. A. Browna „Klonování genů a analýza DNA“ Poděkování: Tento výzkum byl finančně podpořen grantem GAČR 526/09/1639 a Hankuk University of Foreign Studies (HUFS)